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临床上需要咬合重建(occlusal reconstruction)修复的患者群体通常为成年人群,生长发育已停止,颞下颌关节(temporomandibular joint,TMJ)适应能力降低,当接受涉及咬合垂直距离升高(increasing occlusal vertical dimension,iOVD)的咬合重建修复后其髁状突将发生何种形态学改变?OVD升高与咬合创伤(occlusal trauma,OT)和正畸治疗中所用的功能矫治器所引起的反应有无不同?其适应性改建主要体现在哪些环节?机制如何?目前仍不十分清楚。
本实验运用现代修复技术成功建立成年期大鼠OVD升高(iOVD)与咬合创伤(OT)动物模型。在此基础上,采用组织学、免疫组织化学和原位杂交等方法观察了iOVD组和OT组在实验3d、1w、2w、3w、4w不同实验时段颞下颌关节组织形态学变化,髁状突软骨细胞外基质包括酸性粘多糖(GAGs)、Ⅱ型胶原(ColⅡ)和X型胶原(Col X)以及转录因子SOX9在TMJ的表达部位、表达频率及表达强度的变化。从细胞、蛋白和分子水平探讨了咬合变化对TMJ的影响及其机制。
第一章 OVD升高动物模型的建立
目的:建立成年期大鼠OVD升高和局部咬合创伤动物模型,探讨建模过程中控制咬合高度和可重复性的方法。评价两种动物模型牙列与颌位的改变及其对全身营养摄入的影响。
方法:90只成年期(15周龄)Wistar大鼠,体重275±25g,分为五个大组,每组18只,每个大组分为3个亚组,分别为对照组、咬合垂直距离升高(iOVD)组和咬合创伤(OT)组,每组6只。其中iOVD组大鼠戴双侧上颌后牙平衡咬合板,OT组大鼠右侧戴创伤咬合板;对照组不戴咬合板。运用现代修复技术,包括精细印模技术、粘接技术等完成iOVD和OT咬合板的制作和粘接,各大组分别在实验3d、1w、2w、3w、4w处死动物。通过定期检查、头侧位X光片拍摄、大体标本解剖及牙体牙周组织学切片等,观察和评价OVD升高大鼠对全身的影响及牙列、颌位与咬合改变情况。
结果:对照组、iOVD组和OT组大鼠的体重增长曲线基本一致,经重复测量方差分析结果没有统计学差异。OT组大鼠实验3d下颌开始偏向创伤侧,1w偏斜程度最大,随时间延长逐渐改善,同侧咬肌代偿性增大,牙列出现不规则磨耗,以创伤侧早接触区为重。iOVD组大鼠未见咬合偏斜、单侧咬肌增大及不对称牙列磨耗现象;牙体牙周组织病理改变明显比OT组轻。X光片显示髁状突向前向下移位;2w~4w切牙逐渐继萌补偿升高的颌间距离。
结论:通过修复的方法可成功建立成年期大鼠咬合垂直距离升高(iOVD)与咬合创伤(OT)动物模型;其中咬合创伤咬合板可达到预定升高高度和定点咬合早接触的目的,而iOVD咬合板可保证双侧咬合高度的均衡性。两种咬合板戴入后均未明显影响全身营养的正常摄入。
第二章 OVD升高后TMJ组织形态学观察
目的:观察咬合垂直距离升高(iOVD)和咬合创伤(OT)大鼠颞下颌关节组织形态学改变。
方法:采用常规HE染色切片,观察对照组、iOVD组及OT组大鼠在实验3d、1w、2w、3w、4w后颞下颌关节各部分的病理改变及其转归。
结果:大鼠TMJ滑膜组织的改变:OT组大鼠在实验早期3d~1w创伤侧TMJ内滑膜出现明显炎性反应,主要表现为滑膜细胞的增生,吞噬小泡增加;而iOVD组早期滑膜反应相对较轻,出现缓慢适应性改变。髁状突软骨的病理改变:咬合创伤大鼠髁状突软骨出现了病理性反应和适应性改建。病理性改变主要包括关节软骨细胞水肿、软骨细胞簇状增生、表面切线裂、软骨基质粘液样变、洞穿等,病变以创伤侧为重,后期出现修复性改健;iOVD组软骨反应相对较轻,3d出现软骨细胞水肿,1w出现软骨细胞簇状增生,3w可见中后区和中区软骨增厚等适应性改建,左右无明显差异。
结论:咬合创伤后成年大鼠TMJ表现为早期滑膜炎性反应、关节软骨的应急反应和退行性改变以及后期的代偿性修复过程。OVD升高后大鼠TMJ表现为早期轻度的滑膜炎性反应及髁状突软骨逐渐过渡的适应性改建过程。
第三章 OVD升高后TMJ内GAGs的表达及软骨内成骨的定量分析
目的:通过观察咬合垂直距离升高(iOVD)和咬合创伤(OT)大鼠颞下颌关节髁状突软骨内氨基多糖(glycosaminoglycans,GAGs)的分布变化,探讨咬合升高和咬合创伤对髁状突软骨细胞外基质代谢的影响。
方法:采用Alcian Blue-PAS染色法对各组切片进行染色,观察iOVD和OT大鼠在实验3d、1w、2w、3w、4w后颞下颌关节髁状突软骨内GAGs分布的变化。并通过图像分析测量髁状突软骨与新骨厚度的变化。
结果:GAGs主要分布在髁状突软骨的增殖层、成软骨层基质,增殖层、成软骨层和肥大层细胞内;少量分布于关节窝后附着区及纤维软骨层内;关节盘纤维间也见散在分布。在OT组1w时创伤侧髁突内GAGs表达的范围(面积比率)和强度(累积光密度IOD值)均明显减少(P<0.05),而2w后差异不明显。iOVD组GAGs表达范围和强度与对照组未见明显差异(P>0.05)。
结论:咬合创伤对TMJ髁状突软骨内的蛋白多糖合成有不同程度的影响,其中OT组创伤侧髁状突软骨内GAGs表达受影响较明显;OVD升高对GAGs合成的影响相对较缓和,未引起GAGs表达范围和强度及软骨和新骨厚度测量值的明显变化。
第四章 OVD升高后TMJ髁状突软骨内SOX9、ColⅡ和Col X的表达
目的:通过对髁状突软骨内Ⅱ型胶原(TypeⅡ collagen,ColⅡ)、X型胶原(Type X collagen,Col X)mRNA和转录因子SOX9基因的表达变化,从蛋白和分子水平探讨咬合垂直距离升高和咬合创伤对MJ髁状突软骨的影响机制。
方法:采用免疫组织化学染色法,观察iOVD和OT大鼠在实验3d、1w、2w、3w、4w后颞下颌关节髁状突软骨内ColⅡ和SOX9的分布,并通过计算机图像分析法对髁状突自前到后各区内软骨各层的ColⅡ和SOX9阳性表达率和表达强度(IOD值)进行半定量分析;采用原位杂交染色法,观察Col X mRNA在髁状突软骨自前到后各区内软骨各层的表达,并观察其与其它因子阳性表达的相关性。
结果:ColⅡ主要分布在髁状突软骨成软骨层的基质,成软骨层、肥大层软骨细胞内,关节盘前带、后带的软骨样细胞内及关节窝纤维软骨增殖层、纤维软骨层的基质和细胞内。实验1w时OT和iOVD实验组ColⅡ在髁状突中的阳性表达率下降,尤其是增殖层基质中下降明显(P<0.05);在成软骨层细胞中iOVD组的ColⅡ阳性率增高(P<O.05)。ColⅡ总体光密度IOD值三组间无统计学差异(P>0.05)。
SOX9主要分布在髁状突软骨的增殖层和成软骨层细胞内;关节盘前带、后带的软骨样细胞内及关节窝纤维软骨的增殖层、纤维软骨层的细胞内。实验3d iOVD组SOX9阳性细胞数明显比对照组多(P<0.05),1w~4w未见明显差异;3d、1w OT组非创伤侧SOX9阳性率在明显增高,与对照组、iOVD组及OT组右侧均有统计学差异(P<0.05),而OT组创伤侧SOX9阳性率始终呈低水平表达。表明实验早期iOVD组和OT组非创伤侧成软骨细胞分化活跃。
Col X表达在髁状突软骨的成软骨层基质及软骨细胞内,关节窝纤维软骨增殖层、纤维软骨层的基质和细胞内。正常成年大鼠髁状突软骨内Col X呈低水平表达;OT组右侧和iOVD组髁状突软骨内Col X表达在实验3d和1w、3w呈现明显波动性增强—减弱—增强的波动性变化。
结论:咬合创伤和垂直距离升高导致颞下颌关节髁状突软骨ColⅡ和Col X两种软骨胶原和转录因子SOX9的蛋白质出现不同程度异常表达波动性变化;其中iOVD组和OT组非创伤侧软骨内成骨活动在早期显现活跃的趋势,实验2w后均逐渐达到平衡。
总之,成年大鼠可通过牙列与(牙合)的改建适应新的咬合高度,在此期间颞下颌关节内部也通过细胞、蛋白和分子水平的调节达到新的平衡。其中ColⅡ、Col X、GAGs等细胞外基质的代谢出现不同程度的适应性变化,SOX9基因参与了软骨内成骨的调节。但关节软骨的改建是一个复杂的过程,多种因子参与了调节和反应,其中的内在联系还需进一步研究。