[研究背景]类风湿关节炎（Rheumatoidarthritis,RA）是一类以反复发作的滑膜炎症、关节内持续进展的骨破坏为主要病理特征的自身免疫性疾病。甲氨蝶呤（Methotrexate,MTX）作为一线药物,可以有效阻断部分早期RA进展至骨质破坏阶段,但其全身副作用较大,患者依从性较差,临床长期用药受限。因此,亟需找到一种有效、安全且临床应用广泛可行的治疗方案。多项研究表明,纳米载药技术通过静脉给药途径,结合材料本身靶向性能或是滞留效应,可以有效改善药物的体内分布。但是,纳米材料因其对药物的缓释可因为首过作用大而造成药物降解量增大,继而降低药物的生物利用度。如何安全、有效增加病变局部药物有效浓度从而提升疗效、降低全身副作用成为该疾病领域的关键问题。低频超声作为一种非侵入式纵波,可被用于肿瘤、溶栓领域中纳米载体的控释。但在RA治疗领域,使用低频超声作为药物的靶向控释方法的相关研究尚未报道。RA的发病关节滑膜中具有特征性新生血管翳。大量研究表明,iRGD环肽能与新生血管翳处高表达的整合素-αvβ3受体高度特异性结合。本研究拟以整合素-αvβ3为靶点,通过构建iRGD靶向载MTX和吲哚菁绿（Indocyanine green,ICG）的声学脂质体（the Echogenic liposomes containing MTX and ICG decorated withiRGD peptide,iELPs）,联合荧光成像引导,利用低频超声实现药物的定点精准控释,通过体内外实验,研究其对RA小鼠炎症关节的治疗效果。第一章 靶向声学脂质体的制备与表征目的本章通过探索iELPs的最佳制备条件,拟成功构建iELPs,并对其进行理化性质和生物学性质表征,通过体内、体外实验对iELPs的靶向性进行研究,为iELPs的稳定制备提供技术支持,为其进一步应用于RA治疗及疗效监测奠定基础。方法（1）本研究通过既定磷脂配比,使用薄膜水化法制作iRGD多肽介导的载ICG和MTX的靶向声学脂质体前体,利用真空冷冻干燥技术使声学脂质体前体磷脂双分子层内形成稳定存在的空气核,得到靶向声学脂质体（iELPs）,使用类似方法得到非靶向声学脂质体（the Echogenic liposomes containing MTX and ICG decorated without iRGD peptide,ELPs）。本研究对靶向声学脂质体的形态、粒径、分布、包封率及稳定性进行表征并测定。（2）使用免疫印迹试验量化人脐静脉内皮细胞株（Human umbilical vein endothelial cell line,HUVECs）、类风湿关节炎滑膜成纤维细胞株（MH7A）、小鼠原代巨噬细胞株（RAW 264.7 cells）中αvβ3受体膜蛋白的表达定量。利用HUVECs细胞株、RAW 264.7细胞株、MH7A细胞株对iELPs的靶向能力及特异性性进行定性及定量的评价。（3）利用完全/不完全弗氏佐剂与牛Ⅱ型胶原蛋白混合乳化浊液建造胶原蛋白诱导关节炎（the Collagen-induced arthritis,CIA）模型小鼠,通过大体观察、微型计算机层析成像（Micro-computedtomography,Micro-CT）三维重建技术、组织病理学、免疫组化对其发病状况进行多项评估,并通过近红外荧光（Near-infrared fluorescence,NIRF）成像技术初步验证 iELPs 体内靶向能力、影像引导治疗可行性。结果（1）成功制备的iELPs粒径为（113.35±4.61）nm,多分散指数（Polydispersity index,PDI）为 0.22±0.01,电位（-12.27±3.37）mv,为负电荷,MTX包封率为（68.72%±0.64%）,ICG包封率为（99.14%±0.82%）,冻干状况下可保持粒径稳定状态达五周以上,1 2小时MTX血清药物渗漏率低于30%,具有一定血清稳定性。（2）体外实验结果表明,αvβ3受体膜蛋白在HUVECs细胞株中表达水平最高,MH7A细胞株次之,RAW 264.7细胞株最低。不同脂质体药物组与HUVECs细胞株分别孵育后,iELPs组较ELPs组细胞质间的红色荧光信号强度明显提升;使用iELPs与三种不同细胞株共孵育后,HUVECs细胞株的胞质红色荧光信号强度最高。（3）造模成功的CIA模型小鼠表现为四爪红肿、侵蚀性滑膜炎、骨组织破坏性关节炎。免疫组化图像显示,血管内皮生长因子-A（Vascular endothelial growthfactor-A,VEGFA）和肿瘤坏死因子-α（Tumornecrosis factoralpha,TNF-α）分别在关节炎性新生血管内壁及侵蚀性滑膜组织内大量表达。小鼠体内药物NIRF活体成像结果表明,两种脂质体的体内药物保留时间均维持较持久而游离ICG组的体内药物代谢更迅速。小鼠体内药物NIRF离体组织成像结果表明,iELPs组踝关节处荧光信号是ELPs组的7.72倍,iELPs组肝脏处荧光信号是ELPs组的0.77倍,表明iELPs具备一定的RA靶向特异性。结论（1）我们成功合成了形貌规则、粒径均一的iELPs,其粒径稳定在100nm左右,携带轻微负电荷,分散性好,包封率高;（2）iELPs在粒径结构、血液循环、荧光保护三个方面具有良好的稳定性;（3）iELPs在体外对HUVECs细胞系具备良好的靶向性,且制备的冻干过程对iELPs的靶向性未产生影响;（4）iELPs在体内具有良好的RA炎症关节靶向选择能力及特异性,并且可以优化药物的体内分布;（5）iELPs可进行NIRF成像,具备实现生物医学成像的实时示踪并且引导疾病治疗的初步基础。第二章 靶向声学脂质体的可视化定点控释目的本章通过CIA模型的近红外荧光成像实验,评估iELPs在体实时示踪能力,并筛选生物医学成像引导可视化治疗的参数条件,对iELPs的超声控释药物能力进行测试,通过筛选合适的体外细胞学实验超声参数,为iELPs在体内的NIRF成像可视化引导药物定点控释提供新方法。方法（1）根据药物选择将胶原蛋白诱导关节炎（CIA）模型小鼠分为以下3组（6只/每组）;iELPs药物组、ELPs药物组、Free ICG药物组。于尾静脉注射药物后30 min,1h,2 h,3 h,6 h,9 h,12 h,15 h,24 h分别将各组小鼠行NIRF成像并对荧光强度半定量分析,找出峰值时间,并评估荧光示踪能力。根据上述实验得出的iELPs荧光强度峰值时间,于超声处理前、超声处理后、超声处理后3 h将CIA小鼠行NIRF成像并进行荧光强度半定量分析,并评估NIRF成像引导下体内控释iELPs的能力。（2）利用声阻抗特性对iELPs的声学稳定能力进行评估,使用Vevo 2100超高分辨率小动物超声影像系统的高频超声探头（MS-250,24MHz）,于0 min、15 min、30 min、1h、2 h、3 h、4 h采集图像并进行数据分析,评估其声学稳定性。于超声处理前、后对iELPs进行超声成像并对超声回声信号强度进行定量分析,评估其声学响应能力。使用不同超声声压及时间对iELPs进行辐照处理,评估不同超声参数下iELPs药物控释的能力。（3）利用CCK-8试剂盒评估不同超声参数下MH7A细胞株活性,对体外超声控释实验的条件进行筛选。通过对荧光染色下钙黄绿素乙酰氧基甲酯（Calceinacetoxymethylester,AM）/碘化丙啶（Propidium iodide,PI）染色法定性及CCK-8试剂盒细胞活性定量,评估声学脂质体联合低频超声体外细胞增殖抑制的能力。结果（1）小鼠体内药物实时示踪实验结果表明,利用近红外荧光（Near-infrared fluorescence,NIRF）成像对后爪关节炎症部位进行成像,iELPs组CIA模型小鼠踝关节处荧光信号于6 h达到峰值,此时iELPs组荧光信号是ELPs组的2.72倍,是Free ICG组的7.87倍。使用聚焦超声控释小鼠四爪部位药物,超声组荧光强度相较非超声组提升了 2.55倍。（2）室温静置4 h后,iELPs超声图像显示为细密、点状、均一的高回声,仍具备超声成像能力,表明其具备良好的声学稳定性。使用条件为1.0MHz、0.35 Mpa、1 min的低频超声辐照iELPs后,图像由密集、均一的点状高回声变为稀疏、散在分布的粗大点状高回声,同时MTX药物释放率达（81.23%±4.06%）,并且MTX释放率随低频超声声压增加、辐照时间延长而递增,表明iELPs对超声具备良好的声学响应性。（3）选用0.20 MPa超声作用声压、90 s超声辐照时长作为体外细胞增殖抑制实验参数时,细胞活性无明显变化。AM/PI染色荧光图像所示,联合超声处理组的死亡细胞明显多于其他组。不同药物联合低频超声细胞杀伤实验结果表明,iELPs药物组联合低频超声对MH7A细胞株增殖抑制的影响最明显,表现为细胞活性从（53.78%±3.01%）下降为（31.84%±3.02%）。结论（1）我们成功实现了 iELPs的体内NIRF实时示踪及病灶区域浓聚程度实时监测,并通过图像分析测到iELPs经尾静脉注射6 h后,CIA模型小鼠炎症关节部位药物浓聚达高峰,并以此时间点作为超声辐照的时机,引导后续控释治疗;（2）我们通过NIRF成像成功观测到了 CIA模型小鼠体内低频超声引发的药物释放,提高了 iELPs的体内释药效率;（3）iELPs内部空气核的存在,使其声阻抗与周围组织产生差异,具有良好的超声显影效果,并能保持显影能力,稳定维持达4 h以上;（4）iELPs内部空气核具有优秀的低频超声响应能力,经超声辐照后,能够破坏脂质体结构游离至脂质体外,并显著减低超声回波信号;（5）低频超声能够使iELPs内部空气核发生响应,将脂质体结构破坏并使MTX释放至外部;（6）1 MHz频率,0.20MPa声压,90s超声辐照时间是合适的体外治疗实验低频超声作用参数,此参数下MH7A细胞活性不会受到显著影响;（7）从iELPs中释放出来的MTX能够被MH7A细胞有效摄取,并抑制MH7A细胞的活性。第三章靶向声学脂质体类风湿关节炎在体治疗的效果评价目的本章拟建立CIA小鼠模型,对RA的在体治疗超声参数进行安全性评估及筛选,对iELPs联合低频超声在体治疗RA的疗效及生物安全性进行评估,为RA的可视化可控释治疗提供新的研究方向。方法（1）使用不同声压、时长的低频聚焦超声（1 MHz频率,连续波,正弦波）分别辐照小鼠后爪部位或离体肌肉组织,实时监测小鼠皮温变化,辐照后形貌评估小鼠后肢及离体肌肉组织的大体外观,评估超声的热损伤及机械损伤的情况,并筛选在体治疗实验的超声参数。（2）根据低频超声辐照、脂质体主动靶向条件、是否CIA建模三个条件将关节炎指数（Arthritis index,AI）评分达10～12分的CIA模型小鼠分为以下7组（6只/每组）:正常小鼠组、生理盐水组、超声组、MTX组、iELPs组、ELPs联合超声组、iELPs组联合超声组,采用AI评分标准、大体观察、Micro-CT三维重建技术、组织病理学等方法对比评价iELPs联合低频超声的在体治疗效果。最后,通过动物行为观察及组织病理学切片检测各项治疗方案的生物安全性。结果（1）0.35 MPa（1 min、3min、5min）和 0.30MPa（3min,5min）的超声参数条件下,肌肉组织受到明显的热损伤,外观变白;辐照时间≥3min,辐照声压≥0.30MPa时,皮温超过45℃,为热休克蛋白失活温度,同时小鼠腿部红肿不可逆,进而诱发关节区严重肿胀、破溃,远期甚至表现为坏疽,断肢。我们将未对组织产生明显损伤,且功率相对最大的参数（0.20 MPa辐照声压、3 min辐照时间）选为最佳体内低频超声辐照参数。（2）体内治疗实验结果表明,iELPs联合超声组的AI评分最低（平均达4.12分）,其他治疗组评分从低至高依次为:iELPs组、ELPs联合超声组、MTX组、US组/生理盐水组。Micro-CT三维重建图像显示iELPs联合超声组关节部位骨皮质尚光滑,关节间隙结构清晰,且大体观察下小鼠皮毛光亮、精神状态良好、行为活跃,关节柔韧度佳,组织病理学图像仅可探及稀疏点状存在的滑膜细胞。而各对照组均表现为不同程度的骨皮质破坏征象与关节骨质增生并存,关节结构紊乱、腔隙不均匀狭窄,滑膜组织呈片状增殖,多处可见新生血管组织,各项疗效比较差异均具有统计学意义（P<0.01）。安全性评估结果表明,各组药物及治疗方案均对主要脏器结构未造成明显毒性损伤,各组小鼠各个阶段均并未观察到行为发生异常。结论（1）优化出较理想的体内治疗低频聚焦超声参数:1 MHz频率、0.20 MPa声压、连续波、正弦波、超声辐照时间3 min,此参数下的低频聚焦超声对组织未造成明显的热损伤;（2）iELPs联合低频超声治疗能够有效抑制RA的进展,缓解RA的症状;（3）iELPs联合低频超声治疗具有良好的体内生物安全性,不会对小鼠的主要器官（心脏、肝脏、脾脏、肺部、肾脏）组织病理学的细胞形态及排列造成明显损害,小鼠行为活动未发生异常。[全文总结]本研究成功构建了iRGD多肽介导的载MTX及ICG靶向声学脂质体（iELPs）,发挥靶向穿膜肽iRGD的药物靶向递送及加速细胞穿透作用,并利用NIRF成像技术高度图像灵敏度结合ICG的荧光示踪能力,以低频低强度超声定点控释MTX,将超声药物控释治疗与磷脂类纳米医学有机结合,实现了 RA炎症关节的靶向可视化可控释治疗。体内、外实验结果表明,载MTX靶向声学脂质体控释体系可有效选择性杀伤体外MH7A细胞,降低CIA动物模型的AI评分并改善受累关节的影像学表现,是提升RA治疗效果并降低MTX内脏毒副作用的有效策略之一,为未来RA的早期诊断和有效靶向治疗奠定了一定的基础。