昆明小鼠属于哺乳动物，其胚胎的发育过程与人胚胎发育过程有许多相同之处，且妊娠时间短，产量高，给胚胎发育的研究提供较好的生物模式材料，鼠整胚组织切片标本的制作与观察是研究胚胎发育生物学的一个必不可少的重要手段。目前发育生物学研究侧重于生后小鼠发育、胚胎干细胞、细胞基因表达及细胞因子发育调节作用的研究，大部分资料是通过体外分离、培养、观察、研究获得。而针对母体内胚胎发育全过程的相关研究报道不多。现仍有许多疑难问题未能解决，如分化问题、形态发生问题、生长问题、生殖问题、进化问题等一直困惑着生物学家。本研究采用昆明小鼠胚胎为实验材料，采用苏木精—伊红染色、Masson染色、PAS染色、免疫组化染色等方法，研究不同发育时期小鼠胚胎生殖腺、皮肤、肝脏内干细胞的起源、迁移和增殖及形态的变化，探讨生殖腺、皮肤、肝脏发育的机制，为胚胎发育的分子水平调控机制的深入研究提供组织学依据。 一、鼠整胚组织切片标本的制作与观察 选取日龄10～20天小鼠胚胎，采用Bouin固定液固定，梯度乙醇脱水，甲苯透明，石蜡包埋，6um连续切片。结果发现：1)Bouin固定液渗透迅速，固定均匀，组织收缩少，对细胞和组织的微细结构保存效果好；2)脱水从低浓度30％酒精开始，可以防止胚胎组织的过度收缩；3)使用甲苯能够控制透明速度，防止胚胎组织变脆，比二甲苯更适合于胚胎组织切片标本的制作；4)17日龄左右，组织切片标本的制作采用从胚胎中线以矢状面剖开，更有利于胚内各器官的细微结构的保存。 以上结果表明，改良的组织切片标本制作方法有利于小鼠胚胎组织切片经过不同的染色方法完美地显示细胞和组织的形态及某些化学成分的变化，更重要的是它可保证胚内各个器官位置的相对固定，为胚胎干细胞的迁移以及胚胎发育连续观察的研究提供宝贵资料。 二、鼠胚生殖腺发育的形态学及免疫组化研究 采用免疫组织化学的方法标记Oct-4在生殖腺内干细胞中的表达，研究胚胎发育过程中生殖腺的发生、发育机制，同时探讨生殖干细胞新的表面标记蛋白。结果发现：1)生殖腺的发育起始于10日龄小鼠胚胎尿生殖嵴内侧，11日龄出现生殖腺嵴，12日龄形成未分化生殖腺，13日龄胚胎标本切片上可以区分雌雄性;14日龄雄性生殖腺出现翠丸的结构特征，雌性生殖腺于16日龄才开始演变为卵巢;20日龄攀丸内生精小管分化形成两层细胞—底层的支持细胞和表层的生殖干细胞，此时，卵巢皮质出现许多原始的卵泡。2)胚胎发育不同时期，Oct一4在生殖腺内干细胞中的表达呈现动态变化，Oct一4首先在原生殖细胞中呈强阳性染色，阳性细胞数目稀少;随着生精小管的发育，Oct一4阳性细胞逐渐增多，表达逐渐减弱，13一16日龄左右，鼠胚攀丸内主要存在两种Oct一4阳性干细胞，一种为强阳性的原生殖细胞，另一种为弱阳性的精原细胞;17日龄后Oct一4在生殖腺中的表达逐渐减弱。 上述结果表明:1)胚胎发生早期(10日龄左右)表面上皮基底部含有原生殖细胞，原生殖细胞的迁移、增殖和分化与生精小管的发育密切相关。2) Oct一4在生殖腺内干细胞中的表达呈现动态性变化，Oct一4可以作为特异性的表面标记蛋白，强阳性表达在原生殖细胞之中，弱阳性表达在精原细胞之中。最后，伴随着生精小管结构成熟，生殖干细胞进一步分化，Oct一4表达减弱，直至消失。 三、鼠胚皮肤发育的形态学及免疫组化研究 本研究采用HE和Masson染色的方法研究小鼠胚胎皮肤的动态发育过程，同时应用免疫组织化学技术标记nestin在不同发育时期鼠胚皮肤中的表达，研究皮肤内干细胞的定位和形态变化，探讨皮肤发生发育的细胞生物学机制。HE染色结果发现:10日龄鼠胚皮肤由一层扁平细胞构成，与深层间充质细胞之间无明显的分界线。n一12日龄皮肤由双层细胞构成。13日龄的表皮分化为三层并出现表皮峭，开始合成胶原，真皮出现疏松结缔组织。14日龄毛囊原基形成，真皮层增厚，表皮和真皮发生密切的接触。巧一16日龄鼠胚皮肤可明显区分表皮、真皮及皮下组织，皮肤的组织结构逐渐成熟。17日龄鼠胚皮肤具有成体皮肤组织结构特征。18日龄以后皮肤的组织结构基本保持不变。免疫组织化学结果显示:nestin在不同发育时期的鼠胚皮肤中均呈强阳性表达，nestin首先是在表皮前体细胞内表达，然后在基底细胞内表达，最后迁移并停留在毛囊前体细胞和部分基底部干细胞中表达。此外，13日龄左右nestin在皮肤肌母细胞中也呈现强阳性表达。 综上所述:1)小鼠胚胎发育第13一14日龄是皮肤发育最旺盛的时期， 一3-表皮、真皮、毛囊前体细胞的生长都达到空前活跃;2) estin的表达与表皮和真皮的发生和发育以及皮肤干细胞的迁移密切相关，nestin首先在表皮前体细胞内表达，然后在基底细胞内表达，最后迁移并停留在毛囊前体细胞中表达。此外本文在研究nestin在不同发育时期鼠胚皮肤中表达的同时发现nestin在肌母细胞中呈现强阳性表达，提示nestin可能是一种标志性蛋白，不但在未分化皮肤干细胞中表达，在肌肉母细胞中也有表达。