【摘 要】
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转基因作物在当今全球化的背景下被广泛的应用于实际生产中,它们在增加作物产量、病虫害防护、抗逆境等方面具有重要作用。转基因作物同时在突破狭窄的遗传基础的育种瓶颈具有重要的作用。随着现代分子生物学、基因组学的发展,从大量基因中选取最优基因通过遗传改造的方式获得优质的种质资源越来越普遍。水稻是中国最重要的粮食作物之一,如何获得高产、优质种质资源是科研工作者的目标。真核生物在转录过程中产生mRNA前体(p
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转基因作物在当今全球化的背景下被广泛的应用于实际生产中,它们在增加作物产量、病虫害防护、抗逆境等方面具有重要作用。转基因作物同时在突破狭窄的遗传基础的育种瓶颈具有重要的作用。随着现代分子生物学、基因组学的发展,从大量基因中选取最优基因通过遗传改造的方式获得优质的种质资源越来越普遍。水稻是中国最重要的粮食作物之一,如何获得高产、优质种质资源是科研工作者的目标。真核生物在转录过程中产生mRNA前体(pre-mRNA),它们必须经过5’端加帽、可变剪接和多聚腺苷化(polyadenylation,或poly(A))等加工过程才能成具有功能的成熟mRNA。多聚腺苷化是真核生物体内一个重要的过程,绝大多数蛋白质编码基因和长非编码基因都会进行3’末端的切割和多聚腺苷化,这一过程具有维持mRNA稳定、定位、防止mRNA被酶降解等重要生物学功能。多聚腺苷化加工过程中有一系列蛋白质因子参与其中,其中一个是CPSF30蛋白因子。根据前期工作结果,CPSF30基因不同表达量可能会改变植物再生性状。为测试此假说,本文拟用RNA干扰(RNA interference,或RNAi)的方法改变水稻CPSF30基因表达,探究其对水稻农艺性状的影响。我们采用农杆菌介导的方式构建再生稻品种日本晴(Nipponbare)的CPSF30-RNAi转基因再生稻。成功获得了 RNAi靶位点在5’-UTR(5’-untraslatedregion,后文简称RI-5UTR株系)、CDS(coding sequence,后文简称RI-CDS株系)两个RNAi株系和载体对照(vector control,后文简称RI-VC株系)转基因株系。成功获得转基因株系后,在实验室条件下种植转基因再生稻,观察并测定再生稻两茬的分蘖数、结实率、单株粒数和单株产量等产量农艺性状。然后,以转基因再生稻的再生芽为样品,提取总RNA后构建文库,采用3’末端高通量测序方法(PAT-seq)进行高通量测序。通过生物信息学的方法分析CPSF30-RNAi对再生稻的影响及其内在机制。本研究将多聚腺苷化与农作物增产的实际应用联系起来,并利用这一过程提高农作物产量,有助于为“两高一优”提供优异的种质资源,并为进一步的育种和推广奠定基础。主要结果如下:(1)在实验室条件下,RI-5UTR株系植株明显大于RI-CDS和RI-VC株系,并且有较为发达的根系。对转基因再生稻的两茬分蘖数、结实率、单株粒数和单株产量农艺性状进行测定。最终结果显示RNAi位点在5’-UTR时对再生稻的影响较大,在两茬分蘖数、第二茬的结实率、第二茬单株粒数和第二茬单株产量均显著高于RI-VC株系。RI-5UTR株系和RI-CDS的第二茬产量相对于RI-VC株系增加52.6%和41.2%。但在转基因再生稻在第一茬产量和单株粒数上,三个转基因株系间没有显著差异。(2)通过IGV进行差异基因的可视化和RT-qPCR分析,验证了 RNAi确实造成转基因再生稻CPSF30基因表达量的降低。RI-5UTR株系CPSF30表达量介于RI-VC和RI-CDS株系之间。结合表型RI-5UTR株系具有较大的植株,较高的分蘖数等优异农艺性状,说明了适当的CPSF30表达量可以促进再生稻的生长。由PAT-seq结果可知,CPSF30-RNAi会对再生稻的多聚腺苷化位点使用产生影响,并且干扰位点的不同造成了不同的poly(A)位点使用率。其中RI-5UTR相对于RI-CDS而言,对再生稻的poly(A)位点使用率的影响更大,即RNAi位点在5’-UTR时对再生稻poly(A)位点使用率影响更大,poly(A)位点在RI-5UTR中使用率更低。由此说明了 CPSF30基因表达量会影响再生稻的poly(A)位点使用。通过差异基因的GO富集分析可知,主要差异基因涉及生物死亡、生物调控、生物调节过程三个生物学过程的基因比例高于背景的基因比例。由此说明,CPSF30-RNAi转基因再生稻可能主要通过这三个方面的生物学过程参与调控再生稻的基因表达,进而影响再生稻的表型。并且将部分差异基因进行可视化,找到了相关的关键性基因Os WOX11和OsPHT3等为后续研究提供了依据。本实验通过将多聚腺苷化水平与农作物增产的实际应用联系起来,并利用这一过程来增加作物产量,提高农艺性状,有助于发现解决国内与国际粮食危机的新基因资源与途径。获得了较为高产的转基因株系(RI-5UTR),提供了较好的种质资源。基于相关理论基础的应用创新,通过调控CPSF30基因表达量,就有可能对多个基因的表达产生控制作用,达到“一因多效”之功。探究多聚腺苷化过程在调控农作物再生过程中的内在分子机制,特别是多聚腺苷化关键因子CPSF30因子的研究。
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