[目 的]采用单细胞转录组测序技术揭示足底切口疼痛模型小鼠外周血中CD11b+细胞及亚群在术后疼痛中的作用,验证骨髓来源LY6G+CD14+细胞亚群在足底切口疼痛中的作用。[方 法]将C57BL/6小鼠随机分为足底切口疼痛模型组和假损伤组。在小鼠右后爪由足跟部向趾部纵向切开构建足底切口疼痛模型,观察脚掌切口的变化。测量小鼠机械痛和热痛阈值。流式细胞术检测小鼠外周血和脚掌组织中CD11b+细胞和CD11b+LY6G+细胞的变化。H＆E染色观察小鼠脚掌组织中免疫细胞浸润变化过程。采集小鼠外周血,免疫磁珠法分选CD11b+细胞,对其质检,合格后使用10X Genomics上机测序。使用R语言和Loupe Browser浏览器对下机数据进行分析,找到差异表达的细胞亚群和差异表达基因。进一步构建C57BL/6小鼠足底切口疼痛模型,流式细胞术检测小鼠外周血和脚掌组织中CD11b+LY6G+CD14+细胞的变化;免疫荧光观察小鼠脚掌中CD11b+LY6G+CD14+细胞的表达;多重ELISA检测小鼠外周血中促炎细胞因子、抗炎细胞因子、趋化因子的变化。小鼠腹腔注射抗CD14抗体,流式细胞术检测LY6G+CD14+细胞的变化,同时检测机械痛和热痛阈值变化。[结 果]手术后小鼠的脚掌出现红、肿,1d时红肿最为明显,第7d～10d基本恢复正常。手术后6h小鼠的机械痛和热痛阈值都处于最低,在手术后第7d恢复到接近基线水平。手术后小鼠外周血和脚掌组织中的CD11b+细胞急剧增多,12h增加到最多,7d时恢复到基线水平附近。H＆E染色结果显示,足底切口疼痛模型组小鼠在手术后3h免疫细胞开始浸润,手术后1d有大量的免疫细胞浸润,在手术后3d浸润的免疫细胞减少,在手术后7d基本恢复正常。对小鼠外周血中CD11b+细胞的单细胞测序结果进行过滤和注释,注释结果为B cells、Basophils、DC、Monocytes、Neutrophils、NKcells 等细胞类型。提取出 CD11b+的中性粒细胞亚群,把CD11b+的中性粒细胞分为G0～6共7个亚群,其中G0和G1中性粒细胞主要在足底切口疼痛模型组（S）中表达,G2主要在假损伤组（C）中表达,G3～6在两组的表达中相差不大。G0、G1亚群主要表达Wfdc17、Lcn2、CXCL2、CXCL3、CD14等基因。G0和G1细胞亚群GO富集到的生物学功能主要是“behavioral response to pain”及“innate immune response”。中性粒细胞拟时序分析轨迹表明G3和G4亚群的中性粒细胞逐渐发展为G0亚群和G1亚群的中性粒细胞,后者显示出更高的老化分数。单核细胞亚群分为M0～12共13个细胞亚群。单核细胞在足底切口疼痛模型组中的高表达基因主要有Cxcl2、Relnlg、Lcn2、lftm1、S100a9、S100a8、Wfdc17。M2 细胞亚群为术后切口疼痛模型中增多的单核细胞亚群。对单核细胞进行GO富集,其生物学功能为“immune system process”和“neutrophil chemotaxis”。CD14基因在足底切口疼痛模型组中的表达超过假损伤组。在手术后,CD11b+、CD11b+LY6G+CD14+、CD14+、CD11b+CD14+在脚掌组织和外周血中都增加。通过免疫荧光验证,手术后1d时CD11b、LY6G、CD14基因在脚掌组织中表达得最多。通过多重ELISA法检测外周血和脚掌组织中40个细胞因子的变化,发现在手术切口后12h大部分外周血血清中的细胞因子没有观察到显著差异,但在1d时,高达27个细胞因子发生显著性升高。在炎症的早期阶段,促炎细胞因子显著上调,而在炎症消退和组织重塑发生的后期阶段,抗炎细胞因子和趋化因子显著上调。在小鼠腹腔内注射Anti-CD14抗体后,髓系来源的中性粒细胞中表达CD14基因的细胞亚群被耗竭。同时注射Anti-CD14抗体后,在手术12h和1d时的机械痛阈值具有显著差异,热痛阈值在手术后3d和4d显著升高。[结 论]足底切口疼痛模型小鼠在手术后6h疼痛阈值降到最低,手术后7d恢复到基线水平。小鼠手术后外周血中骨髓来源中性粒细胞显著增加,其中G0和G1亚群在足底切口疼痛模型中显著增加,且G0和G1高表达CD14。小鼠手术后单核细胞显著下降,但单核细胞中的M2亚群在手术后增多。小鼠外周血和脚掌组织中的细胞因子变化趋势不同,在炎症早期,主要表达的细胞因子为促炎细胞因子,抗炎细胞因子在炎症晚期增多,主要表现在手术后3d增多。小鼠腹腔注射Anti-CD14抗体后,改变手术后机械性疼痛和减轻手术后热痛。