[目的]肺纤维化(PF)是一种致命性慢性肺病,其病因不明,发病机制尚不明确且预后不良,目前FDA虽然已批准吡非尼酮和尼达尼布两种药物用于肺纤维化的治疗,但这两种药物的远期治疗效果尚不明确,而且伴有严重的胃肠道副作用,病人难以耐受,除肺移植外没有其他有效治疗方法。目前,越来越多的证据表明,以活性氧(ROS)过量产生为特征的氧化应激是肺纤维化的重要分子机制。ROS包括两个亚组:由超氧自由基(O2-)代表的自由基ROS和由过氧化氢(H2O2)代表的非自由基ROS。与自由基ROS相比,H2O2在生理和病理过程中起着更重要的作用,H2O2具有反应性较低,半衰期较长,较容易在质膜和细胞膜扩散等理化性质。在肺纤维化发生过程中,H2O2起重要的促进作用。通常研究肺纤维化使用博来霉素致纤维化模型进行研究。我们设计并合成一种新型近红外荧光探针——Mito-OH,用于研究肺纤维化细胞和动物模型中内源性过氧化氢的变化。[方法]设计并合成了线粒体靶向的近红外小分子荧光探针Mito-OH,Mito-OH由以下三部分组成:azo-BODIPY,4-溴甲基苯基硼酸频哪醇酯和三苯基膦阳离子。检测机制基于硼酸烷基酯或芳基硼酸盐对H2O2的响应,释放荧光团以打开荧光,用于检测肺纤维化细胞模型和小鼠模型中的过氧化氢。在生物系统中进行荧光成像之前,用细胞计数试剂盒-8(CCK8)进行Mito-OH的细胞毒性测定。然后我们选择两种人源性的非小细胞肺癌细胞系(A549和PC9)作为细胞模型,通过与探针Mito-OH共孵育进行激光共聚焦实验来研究活细胞中内源性H2O2的变化。流式细胞术分析用于在0至60分钟内检测细胞荧光强度的变化。Mito-OH研究肺纤维化细胞模型建立过程中H2O2的波动。通过用含有5nM转化生长因子β1(TGF-β1)的无血清培养基分别刺激两种人胚胎成纤维细胞株(IMR-90和MRC-5细胞)24h、48h和72小时,建立肺纤维化细胞模型。在肺纤维化进展期间,不仅会出现细胞形态的变化,而且细胞内蛋白标记物的水平也发生变化。为了进一步探讨内源性过氧化氢水平对纤维化进展的影响,将IMR-90细胞和MRC-5细胞随机分成三组。a组为对照组,细胞在无血清培养基中培养。b组细胞用含有TGF-β1的等体积无血清培养基刺激,终浓度为5 nM,37℃培养72小时。c组以b组为基础,丢弃含有TGF-β1的培养基,然后将细胞与含有无血清培养基的GKT137831(GKT,NOX-4/NOX-1的小分子特异性双重抑制剂)一起孵育。考虑到Mito-OH在细胞实验中的良好结果,我们将其应用于博来霉素诱导的小鼠肺纤维化模型以监测H2O2的变化。在小动物活体成像后,处死小鼠并取出包括心脏,肝脏,脾脏,肺脏和肾脏的器官用于离体器官成像。为了研究小鼠的形态学和病理学变化,对每组小鼠的肺切片进行苏木精-伊红染色(H&E染色)和Masson染色,并在100倍和400倍光学显微镜下观察。[结果]在探针细胞毒性检测实验中,细胞存活率良好,这表明该探针对细胞具有低生物毒性并且能够用于活细胞检测,然后用激光扫描共聚焦显微镜对Mito-OH进行细胞内成像。在与Mito-OH共孵育后,A549细胞和PC9细胞在0至60分钟内显示出荧光强度的逐渐增加,这表明探针已与细胞中的过氧化氢反应并释放荧光团。流式细胞术分析的结果与共聚焦显微镜成像结果一致。在Mito-OH用于研究肺纤维化细胞模型建立过程中,过氧化氢的波动随着TGF-β1刺激时间的延长,荧光强度变强,表明成纤维细胞氧化应激水平越来越高,并且细胞中过氧化氢的量逐渐增加。在流式细胞术分析中也出现了相同的结果。随着实验组细胞刺激时间的延长,α-SMA(一种间充质细胞标记蛋白)的表达逐渐增加。同时,促纤维化因子PAI-1显示出相同的趋势。然而,作为上皮细胞蛋白标志物代表的E-钙粘蛋白的表达显示出下调趋势,表明通过TGF-β1刺激诱导纤维化不断进展。在博来霉素诱导的肺纤维化小鼠模型中,GKT的干预降低肺部的氧化应激水平,减少过氧化氢的产生,有利于延缓疾病的进展,减轻肺纤维化。[结论]一、我们设计并合成了一种线粒体靶向的NIR小分子荧光探针(Mito-OH),用于检测肺纤维细胞和小鼠模型中内源性H2O2的变化。Mito-OH具有光化学稳定性,对过氧化氢具有高灵敏度和选择性;Mito-OH不仅对内源性过氧化氢有良好的响应,而且能灵敏检测到细胞内过氧化氢的波动。二、Mito-OH检测到在细胞肺纤维化模型建立过程中,随TGF-β1刺激时间的延长,内源性过氧化氢逐渐增多,NOX4抑制剂GKT137831能下调过氧化氢水平,延缓或减轻肺纤维化。三、Mito-OH检测到肺纤维化小鼠模型中过氧化氢水平的改变,可作为肺纤维化活动性的有效监测手段。