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猪萨佩罗病毒(Porcine sapelovirus，PSV)可引起猪的肠炎、肺炎、脊髓灰质炎和生殖障碍等多系统疾病，可致猪群出现持续性感染及康复猪持续带毒等现象。PSV能够感染各个年龄段的猪，而且易与猪瘟病毒(classical swine fever virus，CSFV)、猪繁殖与呼吸障碍综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome virus，PRRSV)、猪细小病毒(porcine parvovirus，PPV)和猪捷申病毒(porcine teschovirus，PTV)、猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus，PEDV)、冠状病毒(coronavirus，CoV)和猪圆环病毒2型(porcine circovirus type 2，PCV2)等发生混合感染，导致临床诊断和综合防控的难度增大，给养猪业造成巨大经济损失。目前关于PSV的报道主要集中在流行病学方面，对于该病毒的快速检测方法、感染机制等方面的研究较少。本试验从腹泻仔猪粪便中成功分离到一株PSV毒株，命名为PSVHNHB-01;将该病毒在细胞上连续传代，并对PSVHNHB-01第5代细胞毒(P5)、30代细胞毒(P30)、60代细胞毒(P60)和100代细胞毒(P100)进行全基因组序列测定、遗传进化分析。另外，针对PSV的5非翻译区(5UTR)建立了TaqMan实时荧光定量PCR检测方法。具体试验内容如下:
1.PSV的分离与鉴定。本研究将PSV阳性病料经无菌处理后接种LLC-PK1和ST细胞，加入外源胰蛋白酶(Trypsin和Pancreatin)促进病毒感染细胞，持续观察细胞病变情况。ST细胞在接种阳性病料后，细胞出现变圆、聚团以及胞质颗粒增多等现象。随后，将病毒液收集起来进行PCR鉴定，结果为PSV阳性;将分离的PSV超离、纯化后进行电镜观察，观察到直径约为25nm的球形病毒粒子;利用本实验室制备的猪血清，进行间接免疫荧光试验，在病毒接种细胞的孔内，观察到绿色荧光。结果表明，成功分离到一株PSV，命名为HNHB-01。随后在ST细胞上将病毒进行噬斑纯化，获取PSV的单个克隆株，用于后续病毒传代;用TCID50和qPCR试验对PSV在ST细胞上的生长曲线进行测定，结果显示，PSV感染ST细胞24h后病毒滴度最高。
2.PSVHNHB-01株的细胞传代、全基因序列测定及遗传进化分析。为了解PSVHNHB-01病毒在细胞传代过程中所发生的遗传变异情况。将PSV在ST细胞上进行连续传代，收集第5、30、60和100代的病毒液，进行病毒滴度的测定，结果显示，随着病毒代次增加，病毒滴度也随之增高。之后对PSVHNHB-01株细胞传代毒的全基因组进行测序、相似度比较及差异分析，HNHB-01P5-P100共发生8处氨基酸突变，其中一处在VP1基因;HNHB-01P5-P100的氨基酸相似度为99.9-100％，本分离株与亚洲毒株的氨基酸相似度最高，为88-90.4％，与美国、印度以及欧洲毒株的氨基酸相似度最低，为84.5-85.1％;将PSVHNHB-01株全基因序列及国内外毒株进行遗传进化分析，结果表明，所有的PSV毒株可分为两个类群，GⅠ和GⅡ，本试验分离的毒株与亚洲株处于同一类群，亲缘关系最近，与欧洲株和印度株亲缘关系较远。PSVHNHB-01株VP1基因序列分析表明，PSVHNHB-01P5、P30、P60和P100的VP1基因只发生一个核苷酸突变，造成该位置的氨基酸由S(丝氨酸)变成G(甘氨酸)，HNHB-01P5、30、60和100代病毒的VP1基因的氨基酸相似度为99.9-100％，与中国其他毒株的氨基酸相似度为81.2％;利用Protean软件对PSVHNHB-01P5和P100VP1的抗原性进行分析，从PSVP5到P100，VP1基因只发生一个氨基酸突变，但并未改变其抗原性，即PSV的VP1蛋白在病毒传代过程中未发生变化。
3.PSVTaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立。为建立PSVTaqMan实时荧光定量PCR检测方法，试验参照PSVUSA-IA-33375-2015株(登录号:KX574284)的5端保守区设计了一对特异性引物，经PCR扩增出目的片段，将其克隆至pMD-18T载体获得阳性重组质粒。同时设计PSV特异性引物与探针，以所构建的阳性质粒为模板，建立PSVTaqMan荧光定量PCR检测方法，并对其扩增体系和扩增条件等进行优化，并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证。同时应用所建立的PSVTaqMan荧光定量PCR检测方法对2018-2019年从河南不同地区猪场收集的83份样品(44份肠道样品和39份粪便样品)进行检测。结果显示:该试验成功建立了PSVTaqMan荧光定量PCR检测方法，其检测灵敏度为3.88×101拷贝/μL;与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和PRRSV均无交叉反应，显示出良好的特异性;批内与批间变异系数(CV)小于1.0％，具有较好的重复性。临床样品检测结果表明，应用该方法检测出PSV阳性样品31份(其中粪便样品22份，肠道样品9份)，阳性检出率为37.3％(31/83)，而PSV普通PCR检测出阳性样品10份，其检出率为12.0％(10/83)。该结果表明我们成功建立了PSVTaqMan荧光定量PCR检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性好的特点，为临床快速检测PSV提供了新方法。
综上所述，本试验成功的分离出一株PSV，并将其命名为HNHB-01，并在ST细胞上连续传代，对HNHB-01P5、P30、P60和P100的全基因组及VP1基因进行遗传进化分析，建立了PSVTaqMan实时荧光定量PCR检测方法。为PSV毒株的进一步研究提供了数据参考，同时为PSV的防治提供了重要的理论依据。
1.PSV的分离与鉴定。本研究将PSV阳性病料经无菌处理后接种LLC-PK1和ST细胞，加入外源胰蛋白酶(Trypsin和Pancreatin)促进病毒感染细胞，持续观察细胞病变情况。ST细胞在接种阳性病料后，细胞出现变圆、聚团以及胞质颗粒增多等现象。随后，将病毒液收集起来进行PCR鉴定，结果为PSV阳性;将分离的PSV超离、纯化后进行电镜观察，观察到直径约为25nm的球形病毒粒子;利用本实验室制备的猪血清，进行间接免疫荧光试验，在病毒接种细胞的孔内，观察到绿色荧光。结果表明，成功分离到一株PSV，命名为HNHB-01。随后在ST细胞上将病毒进行噬斑纯化，获取PSV的单个克隆株，用于后续病毒传代;用TCID50和qPCR试验对PSV在ST细胞上的生长曲线进行测定，结果显示，PSV感染ST细胞24h后病毒滴度最高。
2.PSVHNHB-01株的细胞传代、全基因序列测定及遗传进化分析。为了解PSVHNHB-01病毒在细胞传代过程中所发生的遗传变异情况。将PSV在ST细胞上进行连续传代，收集第5、30、60和100代的病毒液，进行病毒滴度的测定，结果显示，随着病毒代次增加，病毒滴度也随之增高。之后对PSVHNHB-01株细胞传代毒的全基因组进行测序、相似度比较及差异分析，HNHB-01P5-P100共发生8处氨基酸突变，其中一处在VP1基因;HNHB-01P5-P100的氨基酸相似度为99.9-100％，本分离株与亚洲毒株的氨基酸相似度最高，为88-90.4％，与美国、印度以及欧洲毒株的氨基酸相似度最低，为84.5-85.1％;将PSVHNHB-01株全基因序列及国内外毒株进行遗传进化分析，结果表明，所有的PSV毒株可分为两个类群，GⅠ和GⅡ，本试验分离的毒株与亚洲株处于同一类群，亲缘关系最近，与欧洲株和印度株亲缘关系较远。PSVHNHB-01株VP1基因序列分析表明，PSVHNHB-01P5、P30、P60和P100的VP1基因只发生一个核苷酸突变，造成该位置的氨基酸由S(丝氨酸)变成G(甘氨酸)，HNHB-01P5、30、60和100代病毒的VP1基因的氨基酸相似度为99.9-100％，与中国其他毒株的氨基酸相似度为81.2％;利用Protean软件对PSVHNHB-01P5和P100VP1的抗原性进行分析，从PSVP5到P100，VP1基因只发生一个氨基酸突变，但并未改变其抗原性，即PSV的VP1蛋白在病毒传代过程中未发生变化。
3.PSVTaqMan实时荧光定量PCR检测方法的建立。为建立PSVTaqMan实时荧光定量PCR检测方法，试验参照PSVUSA-IA-33375-2015株(登录号:KX574284)的5端保守区设计了一对特异性引物，经PCR扩增出目的片段，将其克隆至pMD-18T载体获得阳性重组质粒。同时设计PSV特异性引物与探针，以所构建的阳性质粒为模板，建立PSVTaqMan荧光定量PCR检测方法，并对其扩增体系和扩增条件等进行优化，并对该方法的敏感性、特异性和重复性进行验证。同时应用所建立的PSVTaqMan荧光定量PCR检测方法对2018-2019年从河南不同地区猪场收集的83份样品(44份肠道样品和39份粪便样品)进行检测。结果显示:该试验成功建立了PSVTaqMan荧光定量PCR检测方法，其检测灵敏度为3.88×101拷贝/μL;与猪流行性腹泻病毒、猪传染性胃肠炎病毒、猪δ冠状病毒和PRRSV均无交叉反应，显示出良好的特异性;批内与批间变异系数(CV)小于1.0％，具有较好的重复性。临床样品检测结果表明，应用该方法检测出PSV阳性样品31份(其中粪便样品22份，肠道样品9份)，阳性检出率为37.3％(31/83)，而PSV普通PCR检测出阳性样品10份，其检出率为12.0％(10/83)。该结果表明我们成功建立了PSVTaqMan荧光定量PCR检测方法，该方法具有灵敏度高、特异性好的特点，为临床快速检测PSV提供了新方法。
综上所述，本试验成功的分离出一株PSV，并将其命名为HNHB-01，并在ST细胞上连续传代，对HNHB-01P5、P30、P60和P100的全基因组及VP1基因进行遗传进化分析，建立了PSVTaqMan实时荧光定量PCR检测方法。为PSV毒株的进一步研究提供了数据参考，同时为PSV的防治提供了重要的理论依据。