【摘 要】
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间充质干细胞（MSCs）作为移植治疗心肌损伤疾病种子细胞之一,无论基础还是临床应用研究均有较大突破。但目前对MSCs向心肌细胞分化的机制尚未完全明了,且分化效率和程度均不高,使临床应用受限。因此,进一步研究干细胞向心肌分化过程中的分子机制至关重要。文献报道,Wnt/β-Catenin信号在心肌细胞分化中起着重要作用,然而其作用机制仍未阐明。因此本研究主要对β-Catenin在C3H10T1/2细胞
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间充质干细胞（MSCs）作为移植治疗心肌损伤疾病种子细胞之一,无论基础还是临床应用研究均有较大突破。但目前对MSCs向心肌细胞分化的机制尚未完全明了,且分化效率和程度均不高,使临床应用受限。因此,进一步研究干细胞向心肌分化过程中的分子机制至关重要。文献报道,Wnt/β-Catenin信号在心肌细胞分化中起着重要作用,然而其作用机制仍未阐明。因此本研究主要对β-Catenin在C3H10T1/2细胞心肌特化过程中的作用及其机制进行探寻。实验首先通过构建了敲低β-Catenin的慢病毒,通过慢病毒转染建立了β-Catenin稳定敲低的C3H10T1/2细胞模型。通过显微镜观察其细胞形态变化;免疫荧光、q PCR、Westernblot检测干性因子和心肌标志物变化趋势;流式细胞检测细胞代谢情况。实验发现:（1）随着敲低时间延长,细胞逐渐出现心肌样形态,并且心肌早期转录因子以及心肌标志物的表达水平逐渐增强,在敲低第7天最为显著。说明敲低β-Catenin后会诱导C3H10T1/2细胞向心肌方向分化,并且在敲低第7天其诱导分化效果最显著;（2）通过检测线粒体膜电位,线粒体数量及线粒体ROS水平、线粒体钙离子水平、ATP含量发现C3H10T1/2细胞敲低β-Catenin后,细胞耗能显著增加;（3）过表达β-Catenin后干性因子显著上调,心肌标志物显著降低。明确β-Catenin在C3H10T1/2细胞心肌特化过程中具有关键作用。课题组前期研究发现,在C3H10T1/2细胞心肌特化过程中Islet1具有重要作用,其能与乙酰转移酶（GCN5）结合,增强其转录活性,激活心肌早期转录因子表达。同时研究发现,MLIP与Islet1结合后能显著抑制其转录活性。因此,我们通过Co IP、同位素示踪和Ch IP检测了Islet1、GCN5和MLIP的表达情况。发现:在敲低β-Catenin后,GCN5无论是在转录或翻译水平都无显著的变化,而Islet1和MLIP在翻译水平变化显著,同位素示踪结果显示,其显著变化主要归因于两个蛋白在细胞内的降解。实验结果提示这可能与蛋白的泛素化修饰有关,于是我们通过ubibrowser泛素化数据库,找到了分别与MLIP和Islet1泛素化修饰相关的关键E3泛素化连接酶UBE3C和WWP1,并对其作用和机制进行验证。实验结果发现:（1）敲低β-Catenin后,显著上调UBE3C的表达,通过增强MLIP泛素化修饰,降低其蛋白量;（2）β-Catenin上调Islet1的表达,通过抑制E3泛素化连接酶WWP1的表达而下调Islet1的泛素化修饰;（3）通过Ch IP和荧光素酶报告系统,证实MLIP通过结合Islet1对其转录活性有明显抑制;（4）β-Catenin的敲低可显著下调MLIP的表达,降低MLIP与Islet1的结合,从而进一步促进Islet1和GCN5的结合,提高Islet1转录活性,诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞分化。总之,敲低β-Catenin可调节Islet1和MLIP的泛素化,影响其表达,减少与MLIP与Islet1的结合量,增加其在细胞核与GCN5的结合量。因此,Islet1的转录活性被显著激活,诱导C3H10T1/2细胞向心肌细胞分化。本研究确定了β-Catenin在C3H10T1/2细胞向心肌细胞分化的早期阶段具有关键的调控作用,其作用机制是通过调控下游蛋白Islet1和MLIP的泛素化状态,导致Islet1和MLIP的蛋白表达量发生变化,MLIP表达量显著降低,Islet1表达量在细胞内大量积累,影响了MLIP与GCN5的竞争结合关系,促进GCN5与Islet1结合,激活Islet1激活心肌早期转录因子的转录活性,启动心肌早期转录因子表达,从而诱导心肌早期分化。明确了在C3H10T1/2细胞心肌特化过程中,β-Catenin通过调控泛素化修饰同时影响下游蛋白Islet1的表达和功能的分子调控机制,为MSCs的临床转化应用奠定了理论基础。
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