【摘 要】
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七叶一枝花（Paris polyphylla Smith var chinensis（Franch）Hara）为百合科重楼属（Paris L.）多年生药用植物,以根茎作为药用,具有极佳药用价值。在中药市场具有较大的经济价值以及开发潜力。七叶一枝花的特征产物为甾体皂苷,其在抗肿瘤、抗菌方面的药理作用近年来得到证实。虽然关于七叶一枝花化学成分的分离和鉴定有大量成熟的研究,但对其生物合成途径和关键酶基因
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七叶一枝花（Paris polyphylla Smith var chinensis（Franch）Hara）为百合科重楼属（Paris L.）多年生药用植物,以根茎作为药用,具有极佳药用价值。在中药市场具有较大的经济价值以及开发潜力。七叶一枝花的特征产物为甾体皂苷,其在抗肿瘤、抗菌方面的药理作用近年来得到证实。虽然关于七叶一枝花化学成分的分离和鉴定有大量成熟的研究,但对其生物合成途径和关键酶基因的报道却相对较少。基于此,本课题开展的工作如下:1.采用HPLC-Q-TOF-MS/MS法对七叶一枝花中的化学成分进行分析,通过数据库搜索与标准品比对,推断出35个化学成分。进一步利用HPLC法测定不同生长年限七叶一枝花根茎中重楼皂苷成分含量,获得了七叶一枝花重楼甾体皂苷的含量积累规律。检测发现重楼总皂苷含量在第1年生根茎中含量最高（0.9639%）,其含量约为4年生根茎（0.2307%）的4倍,不同时期存在显著的差异。结合含量及生长年限综合考虑,选择了1a,4a,7a和10a等4个关键时期进行作转录组及蛋白质组研究。2.采用iTRAQ蛋白质组学技术对七叶一枝花4个关键时期（1a,4a,7a,10a）重楼差异蛋白进行定性和定量分析,获得了不同生长年限中七叶一枝花差异蛋白的变化规律。鉴定到了七叶一枝花总蛋白质数量为2637个,至少含有2个Unique肽段的数目为1963个。进一步通过生物信息学分析,发现与七叶一枝花次生代谢相关的蛋白质有426条,其中涉及萜类骨架合成蛋白质有13条,甾体皂苷生物合成通路有5条,从蛋白质层面初步解析了重楼皂苷生物合成途径。3.采用第二代高通量测序技术对七叶一枝花4个关键时期进行髙通量转录组和基因表达谱测序,共得到20.32 Gb Clean Data,组装后获得129085个Unigene。经数据库比对后,62420条Unigene能与Nr、Nt、Swissprot、KEGG、KOG、Pfam、GO等公共数据库匹配,注释率为48.36%,成功构建了七叶一枝花转录组文库。通过对七叶一枝花转录组数据进行挖掘,系统地分析了可能参与重楼甾体皂苷生物合成相关的Unigene,获得了可能参与重楼甾体皂苷合成的20类关键酶候选基因序列594条,其中CYP450和GT基因数目占比较大,达到了483条。这些候选序列涵盖了七叶一枝花重楼甾体皂苷生物合成途径上的所有基因,极大地丰富了七叶一枝花有效成分相关的基因资源。4.采用基因表达谱测序结合DESeq软件和Benjamini-Hochberg方法,分析并获得了七叶一枝花4个关键时期差异表达基因（DEG Unigene）。在1a-VS-10a和7a-VS-10a两组差异比对中得到的差异基因数最多,分别为30909和32860条,其中上调基因分别为12723和14181条;在4a-VS-7a中,上调基因则到达了15823条。通过“含量+转录组+表达谱”共表达模式分析找出15条差异基因,分别编码七叶一枝花甾体皂苷合成途径上的14种酶基因:DXS、DXR、MCT、IDS、AACT、HMGR、MK、MVD、GPS、FPS、SS、SE、CYP450和GT。这些候选基因在4个时期样品中表达量（FPKM）与含量的变化趋势表现一致,由此推测这些酶基因可能在重楼甾体皂苷生物合成中可能起着关键作用。5.对15条重点候选基因设计引物进行PCR扩增和全长克隆,其中13条候选基因能扩增出条带,大小与预期扩增片段长度相符。通过连接、转化及测序,最终获得7条七叶一枝花全长基因,并对其进行了生物信息学分析。采用实时荧光定量PCR技术对于重楼皂苷合成关键酶-糖基转移酶（Glycosyltransferase,PpGT）进行了时空表达分析,其表达量与基因表达谱数据趋势一致。这些全长基因为七叶一枝花重楼皂苷生物合成途径的阐明奠定了基础,为下一步的分子调控及功能验证提供了基因资源。
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