糖苷酶是一类以内切或外切的方式水解糖复合物中糖苷键的酶,在制备活性寡糖、分析多糖结构以及改良食品品质等方面有着广泛的应用。多糖是一类结构复杂的生物大分子,具有多种生物学活性,多糖的结构是其发挥生物学活性的基础。由于分子量大,连接方式多样,多糖的结构分析一直是该领域研究的难题。某些糖苷酶具有高效和选择性好的特点,是分析多糖结构的一种重要手段。但目前发现的糖苷酶种类和功能有限,限制了其在多糖结构分析中的应用。本论文筛选和制备了28种选择性较好的糖苷酶,并选用生物学活性较好的植物果胶（人参果胶RG-I-4）和真菌多糖（红松伞多糖WGRP-N）为模型,利用酶法对它们的结构进行分析,旨在为多糖结构分析提供新的技术和方法。具体研究结果如下:根据待分析的两种多糖含有的糖基种类,获取和制备了商品化和文献报道的30种糖苷酶,其中包括5种阿拉伯糖苷酶、8种半乳糖苷酶、10种葡萄糖苷酶、6种甘露糖苷酶以及1种岩藻糖苷酶。以一系列人工合成的对硝基糖苷（p NP-糖苷）和多糖作为底物,对这些糖苷酶的选择性进行研究。实验结果表明,19种糖苷酶表现出较好的选择性,可以直接用于多糖结构的解析;6种糖苷酶除了具有水解特定糖苷键的能力外,还具有水解其他糖苷键的能力,利用这类糖苷酶进行结构分析时,需要结合多糖的基本结构信息,选择合适的糖苷酶;5种糖苷酶的选择性较差,不适用于复杂多糖的结构解析。利用原核表达体系成功制备出两种新的降解RG-I型果胶主链的关键酶Bh Rgl和Po URgh。Bh Rgl的分子量大小为68.2 k Da,最适反应条件为p H 8.0,温度50°C,Ca2+对酶活力具有促进作用;Po URgh的分子量大小为40.7 k Da,最适反应条件为p H 5.5,温度40°C,Mg2+对酶活力具有促进作用。对两种酶的功能研究表明,Bh Rgl是一种选择性较好的鼠李糖半乳糖醛酸裂解酶,可以作用于RG-I型果胶主链中Rha与Gal A之间α-1,4糖苷键形成不饱和双键;Po URgh是一种不饱和鼠李糖半乳糖醛酸水解酶,可以继续水解Bh Rgl的裂解产物中Gal A△4,5和Rha之间的α-1,2糖苷键,产生单糖和寡糖。利用真菌表达体系成功制备出一种新的水解RG-I型果胶中阿拉伯糖侧链的糖苷酶Po Ara3A。Po Ara3A的分子量大小为32.9 k Da,最适反应条件为p H 4.5,温度35°C,金属离子对酶活力没有明显的促进作用。对Po Ara3A的功能研究表明,Po Ara3A是一种选择性较好的α-1,3-阿拉伯糖苷酶,能够特异性水解甜菜阿拉伯聚糖中α-1,3连接的阿拉伯糖。人参果胶RG-I-4是以α-1,4-Galp A-α-1,2-Rhap二糖单元作为主链,侧链主要含有AG-I、AG-II、β-1,4-Galp和α-1,5-Araf的RG-I型果胶。传统的多糖分析方法只能从整体表征多糖中糖基的连接方式和构型,无法精确的分析某些糖基的连接位置。本论文以上述筛选和制备的选择性较好的阿拉伯糖苷酶、半乳糖苷酶和RG-I型果胶主链降解酶为工具,利用生物酶选择性水解糖苷键的特点,通过分析酶降解多糖的产物进一步解析了RG-I-4的结构特征。RG-I-4经过主链降解酶Bh Rgl作用后得到三个结构域片段RG-I-4-L、RG-I-4-M和RG-I-4-S。RG-I-4-L是分子量大于30 k Da的多糖,以Gal和Ara为主要组成部分,主链含量较低,侧链以β-1,3-Galp为主,还存在少量β-1,4-Galp和α-1,5-Araf,末端主要含有β-1,3-Galp和α-1,3-Araf,是一种AG-II型果胶;RG-I-4-M是分子量为6 k Da的多糖,侧链主要含有较短的β-1,4-Galp和长度适中的β-1,3-Galp,末端主要含有β-1,4-Galp、α-1,5-Araf以及少量α-1,3-Araf,是一种分支度较高（70.5%）的RG-I型果胶;RG-I-4-S是分子量小于3 k Da的寡糖,主链以Galp A△4,5-α-1,2-Rhap和Galp A△4,5-α-1,2-Rhap-α-1,4-Galp A-α-1,2-Rhap为结构单元,部分靠近Galp A△4,5的Rha连接有1-2个β-1,4-Galp,是RG-I-4的主要组成部分,含量高达70%以上。红松伞多糖WGRP-N是以α-1,6-Galp构成主链,侧链以t-α-Fucp为主的多糖混合物。本论文以筛选和制备的半乳糖苷酶、葡萄糖苷酶、甘露糖苷酶和岩藻糖苷酶为工具,通过酶法进一步解析了WGRP-N的结构特征。WGRP-N经分离纯化后得到两个主要的结构域片段WGRP-N-b和WGRP-N-c。WGRP-N-b是分子量为25.1 k Da的葡半乳聚糖,利用岩藻糖苷酶、甘露糖苷酶和葡萄糖苷酶分析其结构特征可知,Fuc几乎全部以末端形式连接在主链α-1,6-Galp的O-2位,Man主要以β-1,4-Manp和t-α-Manp的方式存在,Glc除了以α-1,6的方式存在于半乳聚糖主链中,还存在部分β-1,3和β-1,6的连接方式;WGRP-N-c是分子量为1.2 k Da的半乳葡寡糖,利用半乳糖苷酶和葡萄糖苷酶分析其结构可知,WGRP-N-c主要含有α-1,4-Glcp,以及少量α-1,6-Glcp和α-1,6-Galp。综上所述,本文共获取和制备了可用于植物果胶和真菌多糖结构分析的25种商品化和文献报道的糖苷酶,以及3种新的RG-I型果胶降解酶。利用这些酶解析了一种典型的植物人参果胶RG-I-4和一种真菌红松伞多糖WGRP-N的结构,补充了传统化学法和仪器分析法无法确定的结构信息。研究结果不仅为植物果胶和真菌多糖的结构分析提供了新的技术和方法,也为多糖的构效关系研究奠定了结构基础,对糖生物学研究具有重要意义。