【摘 要】
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多种形式的心血管疾病都会引发心肌纤维化,不可逆的心肌纤维化最终将导致心力衰竭和心源性猝死。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种特殊形式的长链RNA,可通过吸附微小RNA、翻译多肽或者蛋白质、调节宿主基因表达等多种形式参与多种疾病的发病进程。目前,对于circRNA调节心肌纤维化研究的报道还较为有限,本文将研究来源于人宿主基因肌球蛋白IXA（Myo9a）的circ＿00361
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多种形式的心血管疾病都会引发心肌纤维化,不可逆的心肌纤维化最终将导致心力衰竭和心源性猝死。环状RNA（circular RNA,circRNA）是一种特殊形式的长链RNA,可通过吸附微小RNA、翻译多肽或者蛋白质、调节宿主基因表达等多种形式参与多种疾病的发病进程。目前,对于circRNA调节心肌纤维化研究的报道还较为有限,本文将研究来源于人宿主基因肌球蛋白IXA（Myo9a）的circ＿0036176对心肌纤维化相关基因的调控作用。目的:研究circ＿0036176编码蛋白Myo9a-208aa对心肌纤维化表型的调控作用。方法:1.RT-qPCR检测心衰病人心肌组织与外周血中circ＿0036176的表达水平。2.RNase-R消化实验结合放线菌素D干预实验鉴定circ＿0036176的RNA稳定特性。3.荧光原位杂交（Fluorescence in situ hybridization,FISH）实验检测circ＿0036176在人心肌细胞AC16中的核质分布。4.利用定制的抗体（针对翻译蛋白C-端特异氨基酸序列）检测肥厚型心肌病及心力衰竭病人心肌组织中circ＿0036176翻译的蛋白Myo9a-208aa的表达水平。5.利用腺病毒在乳小鼠心肌成纤维细胞（mouse cardiac fibroblasts,mCFs）中分别过表达circ＿0036176和Myo9a-208aa,进行核、质蛋白分离并检测Myo9a-208aa的亚细胞分布。6.RT-qPCR结合Western blot检测过表达circ＿0036176、Myo9a-208aa对mCFs纤维化表型的影响。7.利用流式细胞术、EdU和Trans-well实验检测过表达circ＿0036176、Myo9a-208aa对mCFs增殖、迁移能力的影响。8.利用小干扰RNA敲降Myo9a-208aa阅读框转录本水平,检测对circ＿0036176发挥的抑制mCFs纤维化相关基因表达的影响。9.构建circ＿0036176上编码Myo9a-208aa读框的ATG突变为AG,或读框内7个连续碱基（AAGCACA）缺失的表达载体,Western blot检测两种序列突变的circ＿0036176对翻译的Myo9a-208aa、mCFs纤维化相关蛋白表达及mCFs增殖、迁移能力的影响。结果:1.与健康对照者相比,circ＿0036176在心衰病人心肌组织中高表达,而在外周血中低表达。2.Circ＿0036176在细胞质中富集存在,具有特征性的RNA稳定性。3.用识别Myo9a-208aa C-端特异氨基酸序列的抗体可在肥心病及心衰病人心肌组织中检测到Myo9a-208aa的表达。4.Circ＿0036176翻译的Myo9a-208aa分布于细胞质中。5.过表达circ＿0036176、Myo9a-208aa可一致性地抑制mCFs中纤维化相关基因表达和mCFs的增殖、迁移能力。6.敲降Myo9a-208aa阅读框转录本水平可逆转circ＿0036176对mCFs中纤维化相关蛋白表达的抑制作用。7.Circ＿0036176上编码Myo9a-208aa读框的ATG突变为AG,或读框内7个连续碱基缺失后,可阻断Myo9a-208aa的正确翻译,且对mCFs中纤维化相关基因表达及mCFs的增殖、迁移能力的抑制作用明显降低。结论:1.Circ＿0036176可特异编码Myo9a-208aa。2.Myo9a-208aa在心衰病人心肌中呈高表达并介导circ＿0036176发挥抑制心肌纤维化表型的作用。
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