【摘 要】
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持久性有机污染物（POPs）进入环境难以降解并对人类健康产生极大危害是目前面临的一个亟需解决的问题。其中,芳香族类污染物对硝基苯酚（PNP）和卤代烃类化合物1,2-二氯乙烷（1,2-DCA）被广泛使用和合成并通过不恰当的排放对环境造成了极大污染。恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida KT2440）是环境安全的微生物模式菌株,在生物降解领域有着巨大的应用潜力。本研究采用合成生物学的方法
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持久性有机污染物（POPs）进入环境难以降解并对人类健康产生极大危害是目前面临的一个亟需解决的问题。其中,芳香族类污染物对硝基苯酚（PNP）和卤代烃类化合物1,2-二氯乙烷（1,2-DCA）被广泛使用和合成并通过不恰当的排放对环境造成了极大污染。恶臭假单胞菌（Pseudomonas putida KT2440）是环境安全的微生物模式菌株,在生物降解领域有着巨大的应用潜力。本研究采用合成生物学的方法以该菌株为底盘细胞构建高效矿化PNP和1,2-DCA的工程菌株,对环境修复具有重要意义。第一部分将完整的PNP生物降解途径以及绿色荧光蛋白GFP通过合成生物学的方法引入到KT2440的基因组,RT-q PCR和降解实验验证了降解基因在宿主菌中成功转录且菌株具备PNP降解功能。构建的工程菌株KTU-PNP具有良好的生长性能及降解基因的遗传稳定性,并可以在10天矿化25 mg/L的污染物PNP。菌株中引入的GFP蛋白为菌株在环境修复中的监测提供了可能。随后通过P.putida KT2440的转录组分析和启动子工程,从KT2440中鉴定出5个强启动子,并将每个强启动子都独立插入KTU-PNP基因组的pnp AB基因上游来提高工程菌株KTU-PNP的PNP生物降解能力,最终得到插入P8启动子的突变株的PNP降解率最高,对高浓度PNP（200 mg/L）具有较强的耐受性。使用P8启动子调控所有PNP降解基因pnp ABCDEF的转录时,稳定同位素13C标记的PNP转化实验证明了菌株KTU-P8pnp的PNP高效矿化,达到了7小时即可矿化25mg/L PNP的降解率,且在土壤修复中具有高效PNP降解率。这种结合途径构建和启动子工程的策略为创造高效的生物修复降解菌株开辟新的途径。第二部分通过无痕基因编辑技术将来自自养黄色杆菌（Xanthobacter autotrophicus GJ10）的dhl A（卤代烃脱卤酶）、ald-d H（氯乙醛脱氢酶）、dhl B（卤代烷酸脱氢酶）基因和来自自养黄色杆菌（Xanthobacter autotrophicus Py2）的meoh-d H（乙醇脱氢酶）基因组成的有氧矿化1,2-DCA的途径整合至P.putida KT2440的基因组中构建了矿化1,2-DCA的工程菌株KTU-DCA。降解菌株KTU-DCA中4个外源降解基因可以在宿主细胞中成功转录并可以利用0.5mmol/L的1,2-DCA作为唯一碳源生长。利用第一部分筛选得到的P.putida KT2440强内源启动子P8强化了整个1,2-DCA降解途径,成功构建了生长性能良好且遗传稳定的工程菌株KTU-P8DCA,其对高浓度1,2-DCA有耐受性并且具有高1,2-DCA降解效率。该菌株在14小时内可以完全矿化0.5 mmol/L1,2-DCA,比KTU-DCA的矿化能力提高了15倍,有望应用于1,2-DCA的原位环境修复。
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