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慢性乙型肝炎由HBV病毒引起的一种传染性很强的疾病,在全世界范围内广泛流行,并可引起急慢性肝炎、肝硬化、肝代谢失常、肝癌等,严重威胁着人类的生命健康。虽然乙肝疫苗能有效抑制乙型肝炎的感染,但其对已感染的人群无效及抗体滴度逐年下降等缺陷,全球仍有数以亿计的HBV病毒感染患者[1-3]。目前临床上防治乙肝的药物主要是核苷类和干扰素,核苷类药物主要通过抑制病毒DNA聚合酶和反转录酶的活性,对病毒DNA的复制具有很强的抑制作用,但是由于长时间使用,病毒DNA发生变异而耐药,导致原有的药物作用降低、失效甚至副作用增加,而且停药易反弹,难以彻底清除病毒。干扰素主要增强机体的免疫力而具有抗HBV的作用,但是干扰素存在耐受性差,适应范围窄,给药不便,不良反应多,远期治疗效果不理想等原因,使其临床使用受到限制。因此,开发研究新的抗乙肝药物迫在眉睫。FNC(2’-脱氧-2’-氟-4’-叠氮-核苷类似物)是一种新型核苷类化合物,由郑州大学化学与分子工程学院合成。研究表明,FNC毒性较低且具有良好的抗HBV、HCV及抗肿瘤活性;FNC对HBV野生型Hep G2.215细胞模型、3TC耐药的Hep G2.211细胞模型及鸭乙肝模型都具有良好的抗HBV活性。为了进一步探究FNC的抗HBV作用,我们对野生型Hep G2.CW细胞株、同时耐3TC和ETV的Hep G2.LER细胞株及HBV转基因小鼠进行了实验。本课题分两部分,第一部分为体外实验,通过野生型Hep G2.CW细胞和双重耐药型Hep G2.LER细胞,采用CCK-8法检测FNC的毒性,运用ELISA和FQ-PCR法分别检测给药3、6、9天HBs Ag、HBe Ag分泌及细胞内外HBV DNA复制的影响,来探究FNC体外抗乙肝活性;第二部分为体内实验,对转染了人类HBV的转基因小鼠进行实验,通过对小鼠血清HBs Ag、HBe Ag的分泌、血清HBV DNA、肝脏核心颗粒的检测指标及病理切片,来探究FNC对体内抗乙肝的作用。第一部分:FNC体外抗HBV活性研究。[目的]探究FNC对野生型Hep G2.CW细胞及双重耐药的Hep G2.LER细胞的抗乙肝活性。[方法]采用CCK-8法检测FNC对Hep G2.CW细胞和Hep G2.LER细胞的毒性,再于第3、6、9天收集细胞及上清,用ELISA法检测FNC对Hep G2.CW细胞和Hep G2.LER细胞上清抗原分泌的影响,同时用FQ-PCR法检测FNC对上清及细胞内HBV DNA复制的作用,分别以ETV、ADV做阳性对照。[结果](1)FNC对Hep G2.CW细胞的作用。9天时,0.1μM FNC对Hep G2.CW细胞HBs Ag、HBe Ag分泌的抑制率分别69.62%、73.32%,同浓度下阳性药ETV为22.52%、2.26%;FNC对Hep G2.CW细胞上清及细胞内HBV DNA的抑制率为98.73%、99.56%,阳性药ETV为99.51%、90.26%。另外,对3、6、9天样品的检测,发现FNC具有明显的时间和剂量依赖性;(2)FNC对Hep G2.LER细胞的作用。与(1)作用相似,FNC对Hep G2.LER细胞HBs Ag、HBe Ag分泌及细胞内外HBV DNA都有很强的抑制作用,且比阳性对照药ADV具有更强的优势;FNC对Hep G2.LER细胞具有时间剂量依赖性。[结论]FNC不仅对野生行Hep G2.CW细胞具有很强的抗HBV作用,而且对双重耐药Hep G2.LER细胞具有很强的抗HBV活性,且抑制作用比市场流通的阳性药ETV、ADV效果差不多或更强,具有广阔的开发前景。第二部分:FNC体内抗HBV活性研究。[目的]探究FNC对HBV转基因小鼠的作用。[方法]将符合标准的转基因小鼠分组,口腔灌服不同剂量的FNC溶液,持续给药14天,以ETV为药性对照。用ELISA、FQ-PCR法检测小鼠血清HBs Ag、HBe Ag抗原分泌、血清HBV DNA及肝脏核心颗粒复制情况,并对小鼠肝脏进行病理切片观察,综合评价FNC抗HBV及保肝作用。[结果]FNC对转基因小鼠的作用具有明显的雌雄差异,对雌鼠和雄鼠HBs Ag抑制率最高分别为34.78%、60.79%,雄鼠HBe Ag为34.70%,雌鼠对HBe Ag无效;FNC对雌鼠和雄鼠血清HBV DNA最高抑制率为52.27%、68.49%,高于阳性对照ETV的10.82%、58.84%;对雌鼠和雄鼠肝脏核心颗粒的最高抑制率分别为97.32%、95.23%,与阳性对照药ETV(96.92%、98.59%)相差不大;病理切片观察,FNC具有明显的保肝作用,而ETV对肝脏有一定的毒性,脂肪空泡较多。[结论]FNC对转基因小鼠具有很强的抗HBV作用,且具有很好的保肝作用,活性甚至强于阳性对照药ETV,具有很高的研究价值。第三部分:全文总结。总体概括一类化药FNC体内及体外的抗乙肝活性,同时对其未来的研究前景进行展望并说明实验存在的问题。第四部分:文献综述。对目前临床应用抗乙肝药物的现状做一综述,分别从核苷类、中药类、免疫调节剂、基因治疗等方面进行阐述。