液晶态胶原复合部分脱蛋白骨制备新型骨移植材料研究

来源 :昆明医科大学 | 被引量 : 0次 | 上传用户:raincy
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[目的]为解决临床上大面积骨缺损修复困难的问题,本研究采用骨组织工程策略,使用液晶态胶原复合部分脱蛋白骨制备新型骨移植材料,对材料体外进行扫描电镜观察、含氮量测定、孔隙率测定、力学检测等相关检测,并分离培养兔骨髓间充质干细胞接种于复合支架,探究新材料的生物相容性及成骨性能等,为下一步动物体内组织工程骨修复骨缺损实验提供理论依据。[方法]①按文献方法制备液晶态胶原并确定使其与PDPB复合的最佳浓度,并制备A组(液晶态组):液晶态Ⅰ型胶原-部分脱蛋白骨复合材料(Lc-COL I-PDPB);B组(普通胶原组):普通Ⅰ型胶原-部分脱蛋白骨复合材料(COL I-PDPB);C组(部分脱蛋白组):部分脱蛋白骨材料(PDPB),偏光显微镜下及电镜下观察各组材料,微量凯氏定氮法测定三种材料的含氮量,Micro-CT测定材料孔隙率,万能生物力学测试仪检测材料的三点抗弯曲、抗压缩、弹性模量等力学指标;②抽取新西兰兔骨髓,分离、纯化BMSCs,进行体外培养、鉴定,并对其生物学特性进行研究;③将BMSCs接种到三种材料上培养,采用CCK8法检测各材料上BMSCs的增殖情况,扫描电镜下观察细胞在复合支架上的附着及生长情况,ALP定量分析、茜素红染色检测细胞在液晶态胶原探究其成骨诱导性能。[结果]①制备的胶原为Ⅰ型胶原,液晶态Ⅰ型胶原胶原薄膜在POM镜下,随着胶原浓度增加,可以观察到明显的黑白交替的条带状结构,胶原浓度到100mg/ml时,扫描电镜下可见液晶态Ⅰ型胶原-部分脱蛋白骨复合材料支架材料表面出现出明显的有序的胶原纤维波浪型结构。力学检测结果,压缩:F=128.37,P=0.000,P<0.05,说明三组材料的压缩有差异,经LSD-t检验,液晶态胶原的抗压缩性能优于普通胶原组及PDPB组,普通胶原组的抗压缩性能优于PDPB组,P<0.05,差异有统计学意义。弹性模量:F=1.01,P=0.389,P>0.05,说明三组材料的弹性模量无差异。三点弯曲:F=518.26,P=0.000,P<0.05,说明三组材料的三点弯曲有差异,液晶态胶原的抗弯曲性能优于普通胶原组及PDPB组。含氮量检测结果,F=201.406,P=0.000,P<0.05,说明三组材料的含氮量有差异,经LSD-t检验,液晶态胶原组的含氮量高于普通胶原组及PDPB组,P<0.05,差异有统计学意义。Micro-CT测定结果分析后得出,液晶态胶原组材料孔隙率为 80.169±0.298%,普通胶原组为 80.543±0.381%,PDPB 组为 80.416±0.484%,差异无统计学意义;②原代培养BMSCs刚接种BMSC 24 h后即有一些单个的黏附贴壁细胞,呈纺锤状或多边形,6 d可见大多数克隆由梭形、多突状的成纤维样细胞构成,传代后,分离的细胞贴壁生长,呈均一的长梭形,增殖迅速,第6 d达90%融合,分离培养出来的细胞与骨髓间充质细胞体外培养的形态非常相似。流式细胞术检测结果示CD29和CD90高表达,CD80和CD45不表达或表达极少;钙化结节经茜素红钙染色呈桔红色,互相融合,形成大片钙化影;③细胞培养3天时,正常组细胞密度较大,细胞培养6天时,液晶组和非液晶组细胞密度较大。成骨诱导7天、14天、21天的茜素红染色鉴定均显示,液晶态胶原组成骨最多,普通胶原组次之,空白组最少。成骨诱导7天、14天、21天的ALP定量分析结果表明液晶态胶原组成骨最多,普通胶原组次之,空白组最少。CCK8结果表明,支架材料生物相容性良好,骨髓间充质干细胞在液晶态胶原复合部分脱蛋白骨支架生长增殖更好(P<0.05)。培养第6天扫描电镜下可见液晶态胶原组细胞密度较大,大多数细胞呈多角型或椭圆形。[结论]①液晶态Ⅰ型胶原复合部分脱蛋白骨支架材料表面的胶原层具有胶原纤维波浪型拓扑结构,且复合的胶原蛋白含量更高,力学性能更好,孔隙率符合松质骨孔隙率要求;②本实验分离出的细胞扩增能力强,增殖稳定,细胞高表达CD29、CD90,不表达或极少表达CD80、CD45,定向诱导分化后表达成骨细胞特征,可以证明分离培养的细胞是骨髓间充质干细胞;③制备的液晶态Ⅰ型胶原复合部分脱蛋白骨支架细胞相容性良好,相比对照组支架更有利于细胞附着、增殖、分化。
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