ARTP诱变改造浓香型大曲产酯微生物及在苦荞白酒发酵中的应用

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浓香型白酒是中国最受欢迎的蒸馏酒之一,己酸乙酯是它的主要风味物质,其酯含量比例决定浓香型白酒的品质。己酸乙酯的前体物质是己酸,对浓香型白酒的风味起着举足轻重的作用。浓香型白酒风味特征是由微生物多样性决定的,传统发酵工艺中,酯风味主要由发酵能力较强的产香酵母、细菌和霉菌等酯化生成。目前发现梭菌属细菌、瘤胃菌科、巨球型菌属、芽孢杆菌属细菌等都具备产生己酸的能力。如今,这些微生物主要集中在分类、分离、筛选及应用的研究上,在微生物遗传改造的研究上鲜有报道。苦荞富含较多的功能性物质,例如黄酮、多酚类活性物质,苦荞在酿造中能被分解成小分子物质,是白酒发酵优质的原材料之一,应用于白酒酿造上可提升酒的营养价值,其市场潜力巨大。本论文主要利用从浓香型大曲分离的菌株为出发菌,利用常压室温等离子体技术(ARTP)诱变选育具有高产酸和产酯潜力的菌株,通过研究菌种的生理生化特性、遗传稳定性及其在人工酯化体系中的能力评价,随后进一步探讨诱变菌在苦荞白酒酿造中的应用,着重研究苦荞白酒发酵工艺的优化,并对优化组苦荞白酒的品质和风味变化作初步分析和评价,所得出的主要研究结果如下:1、通过微生物形态学观察,生理生化反应,分子生物学手段鉴定了本论文的出发菌种为Saccharomycopsis fibuligera(扣囊复膜酵母)和Bacillus velezensis(贝莱斯芽孢杆菌)。Saccharomycopsis fibuligera菌落呈微黄色,较为潮湿,中部凸起,边缘光滑且不透明、易挑起,革兰氏显色后有假丝状的分支形态;生长对数期在20–40 h,既不与硫酸铜溶液显色(显色不明显),也不产气。Bacillus velezensis菌落呈现微黄色,较为潮湿,光滑不透明、不易挑起,革兰氏显色后呈现杆状和孢子;生长对数期在2–6d,与硫酸铜溶液显色产生浅绿色沉淀,杜氏管试验产气。说明Saccharomycopsis fibuligera是一株不产己酸(产酸量少)的菌种,Bacillus velezensis产己酸明显的菌种。2、通过ARTP技术对两株菌种进行诱变,分别筛选了两株高产酸和产酯的诱变菌种。Saccharomycopsis fibuligera最佳诱变时间是120 s,生长对数期在25 h–50 h,发酵5 d的总酸为5.60 g/L,总酯为5.08 g/L,发酵性能随发酵时间的增加而提高;诱变后pH和酒精耐受能力变强,在低pH 3.2、高酒精浓度5%可以生长;其次,Saccharomycopsis fibuligera诱变菌的最适培养温度是28℃,葡萄糖和NaCl的添加范围分别在10%和5%;诱变后酯化能力增加,是诱变前的6倍,为887.05 mg/5g,且扩繁6代以后的酯化力比较稳定,稳定在903.34 mg/5g;最后,在人工酯化体系的能力评价中发现,乳酸对酯化体系的pH、酒精度、总酸和总酯的影响较大,乙醇的添加对pH、总酸和总酯也有影响,说明Saccharomycopsis fibuligera诱变菌在应用时,体系中的乳酸可促进酯的合成,乙醇过多,可能会抑制菌种的繁殖,从而降低菌种酯的合成能力。Bacillus velezensis最佳诱变时间是90 s,生长对数期在4 d,发酵5 d的总酸为0.36 g/L,总酯为0.528 g/L,发酵性能随发酵时间的增加而提高;其次,Bacillus velezensis诱变前后的pH和酒精在范围内的耐受能力无明显变化,最适培养温度时32℃,葡萄糖和NaCl的添加范围分别在25%和10%;诱变后酯化能力增加,是诱变前的7倍,为1028.35 mg/5g,扩繁6代以后的酯化力比较稳定,在1110.2 mg/5g;最后,在人工酯化体系中四种酸的添加在一定程度上可以促进乙醇消耗,从而促进酯的生成,且体系伴随着酸的消耗和生成。3、通过对酿造苦荞白酒和糟粕发酵工艺初步研究,添加Saccharomycopsis fibuligera种子液时,苦荞白酒的最佳发酵工艺:发酵时间25 d,菌液添加量4%,发酵温度32℃;而糟粕的正交发酵工艺在总黄酮和总多酚指标下不显著,原因可能是没有以糟粕单因素最佳的理化指标设计正交优化试验。添加Bacillus velezensis种子液时,苦荞白酒的最佳发酵工艺:发酵时间30 d,菌液添加量5%,发酵温度32℃;以总黄酮和总多酚为评判指标时,糟粕的最佳发酵工艺有两组,总黄酮(发酵时间20 d,菌液添加量3%,发酵温度36℃)和总多酚(发酵时间25 d,菌液添加量3%,发酵温度32℃)。最后对最佳发酵工艺试验组酿造的苦荞白酒品质及风味物质分析,发现苦荞白酒之间的AHS(酸味)阈值区分明显,且在主成分分析(PCA)具有明显的区分度,其中,两组苦荞白酒均能检测出己酸和己酸乙酯。总体上,对苦荞白酒进行鉴别和风味定性,在未来可以结合感官分析进行客观评价,使结果更准确客观。
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