【摘 要】
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4-羟基异亮氨酸（4-HIL）在治疗Ⅱ型糖尿病方面极具潜力。L-异亮氨酸双加氧酶（IDO）可以通过消耗O2催化L-异亮氨酸（Ile）的C-4羟基化形成4-HIL,同时将α-酮戊二酸（α-KG）氧化为琥珀酸。在实验室前期研究中,将IDO的编码基因ido导入生产Ile的谷氨酸棒杆菌SN01中表达,实现了4-HIL的从头合成。本课题在SN01的基础上,利用三种不同功能的动态调控工具来调节ido的表达,协
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4-羟基异亮氨酸（4-HIL）在治疗Ⅱ型糖尿病方面极具潜力。L-异亮氨酸双加氧酶（IDO）可以通过消耗O2催化L-异亮氨酸（Ile）的C-4羟基化形成4-HIL,同时将α-酮戊二酸（α-KG）氧化为琥珀酸。在实验室前期研究中,将IDO的编码基因ido导入生产Ile的谷氨酸棒杆菌SN01中表达,实现了4-HIL的从头合成。本课题在SN01的基础上,利用三种不同功能的动态调控工具来调节ido的表达,协调Ile、α-KG和O2的供应,并弱化副产物L-赖氨酸（Lys）的合成,以提高4-HIL的产量并降低Lys的产量。Ile转化为4-HIL是整个4-HIL合成途径的最后一步。为了提高IDO的活性,首先对ido的密码子进行优化,得到ido U,并采用7种不同强度的Ile传感器Lrp-Pbrn FEN（LPN）动态上调ido U的表达,促进Ile向4-HIL的转化,构建出7株动态表达菌株D-NI,并以Ptac M控制的ido U静态表达菌株SI作为对照菌株。发酵结果表明:除D-13I外,其他6株菌株的4-HIL的产量得到不同程度的增加,其中D-1I的4-HIL产量最高,为111.1±0.8 mmol×L-1,比菌株SI的产量(89.9±2.5 mmol×L-1)提高了23.5%。α-KG和O2是Ile转化为4-HIL所必需的。为了提高α-KG和O2的供应,在6株4-HIL产量提高的菌株D-NI的基础上,利用低、中、高三种强度的LPN生物传感器来组合动态上调odh I和vgb基因表达,构建6×3×3=54个三基因动态调控菌株D-NINONV。发酵结果表明:有10株D-NINONV的4-HIL产量高于对应的D-NI菌株,其中菌株D-0I7O7V的4-HIL产量最高,达到141.1±15.5 mmol×L-1,比最好的单基因动态调控菌株D-1I提高了27.0%。L-天冬氨酸转化为Ile是整个4-HIL合成途径的上游。然而,Ile积累过多后,反而会抑制IDO的活性。为了持续供应底物Ile并避免过量Ile所导致的底物抑制,采用Ile衰减子Pilv BNC动态下调Ile合成途径中关键基因ilv A的表达,在6株单向动态调控菌株D-NI基础上构建6株双向动态调控菌株D-NIPA。发酵结果表明:与各自的D-NI菌株相比,4株双向调控菌株(D-0IPA、D-5IPA、D-D5IPA、D-7IPA)的4-HIL产量得到提高,其中D-7IPA的4-HIL产量最高,达到123.2±20.5 mmol×L-1,比最好的单向调控菌株D-1I提高了10.9%。为了同时协调IDO的活性、Ile的合成以及α-KG和O2的供应,在7株高产4-HIL的D-NINONV正调菌株基础上,表达Pilv BNC-ilv A,构建7株D-NINONVPA双向调控菌株。发酵结果表明:仅有D-7I7O1VPA菌株的4-HIL产量达到D-7IPA、D-7I7O1V相似水平,为127.1±20.2mmol×L-1,其他菌株4-HIL的产量大幅度降低。Lys是4-HIL合成中的主要副产物。为了降低Lys的合成,将Lys-OFF核糖体开关整合到SN01中Lys合成途径的关键基因dap A序列上游,得到D-RS菌株,在该菌株中转入上述4-HIL产量较高的表达质粒,构建双途径动态调控菌株D-RS-NIPA和D-RS-NINONV。发酵结果表明:D-RS-5IPA和D-RS-0I7O7V菌株4-HIL的产量最高,分别达到177.3±8.9 mmol×L-1和166.0±13.6 mmol×L-1,副产物Lys降低到6.1±0.6 mmol×L-1。因此,通过三种功能的生物传感器对主路和分支途径进行动态调控,可以有效促进谷氨酸棒杆菌中4-HIL的生物合成。
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