背景:近年来耐药肠杆菌科细菌（Drug-resistant Enterobacteriaceae,DRE）的不断出现导致人类发病率、死亡率和医疗费用的增加。DRE的主要耐药机制是其产生的β-内酰胺酶如超广谱β-内酰胺酶（Extended-spectrum-β-lactamases,ESBLs）、Amp C类头孢菌素酶和碳青霉烯酶等水解β-内酰胺类抗生素,以碳青霉烯酶导致的碳青霉烯类抗生素耐药最为严重。根据Ambler分类法（氨基酸序列相似性）,β-内酰胺酶分为A、B、C和D类。新德里金属β-内酰胺酶-1（New delhi Metallo-β-lactamase,NDM-1）属于B类的金属β-内酰胺酶（Metallo-β-lactamase,MBLs）,它能水解除氨曲南以外的所有β-内酰胺类抗生素,面对blaNDM-1细菌在世界范围内的广泛传播,极大地削弱了抗生素的应用效果的现实,研究人员对碳青霉烯类耐药菌的耐药机制和应对策略给予了过多的关注,但很少关注药物压力因素下碳青霉烯类基因阳性菌株的耐药性的演变。在这项研究中,我们进行了携带blaNDM-1基因的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和大肠埃希菌（Escherichia coli）在亚胺培南诱导下的实验室演化,为临床合理使用抗菌药物,避免blaNDM-1阳性细菌耐药性传播和感染提供依据。目的:通过分析数据库收录的blaNDM-1阳性质粒携带blaNDM-1及其它β-内酰胺酶基因,构建质粒pET28a（+）-blaNDM-1并转化细菌,研究不同浓度亚胺培南诱导下携带blaNDM-1基因的野生株K.pneumoniae TH-P12158及转化菌株E.coli DH5α-blaNDM-1和E.coli BL21（DE3）-blaNDM-1的碳青霉烯类及其它抗生素耐药性演变,为临床合理使用抗菌药物提供依据。方法:1.利用NCBI数据库查阅来自国内外携带blaNDM-1质粒及blaNDM-1质粒上连锁其它β-内酰胺酶基因情况,使用Bio Edit和MEGA 7.0软件进行序列的比对分析。2.随机选取碳青霉烯类敏感K.pneumoniae（n=20）和E.coli（n=20）进行药敏试验及PCR扩增β-内酰胺酶基因和16S r DNA基因,并利用菌株的16S r DNA测序序列,使用MEGA 7.0软件构建系统发育树。3.亚胺培南诱导blaNDM-1阳性菌株耐药性演变。构建重组质粒pET28a（+）-blaNDM-1,化学转化法转化至E.coli DH5α和E.coli BL21（DE3）,并采用VITEK-2全自动细菌测定系统检测重组质粒转化前后菌株对临床常用抗生素的耐药性;亚胺培南浓度递增（0.125μg/mL、0.25μg/mL、0.5μg/mL、1μg/mL、2μg/mL、4μg/mL、8μg/mL、12μg/mL）或降低（12μg/mL to 8μg/mL、8μg/mL to 4μg/mL和4μg/mL to 0μg/mL）或取消（12μg/mL to 0μg/mL、8μg/mL to 0μg/mL和4μg/mL to 0μg/mL）诱导碳青霉烯类敏感K.pneumoniae TH-P12158、E.coli DH5α-blaNDM-1和E.coli BL21（DE3）-blaNDM-1,通过微量肉汤稀释法检测亚胺培南和其他抗生素对3株细菌的MIC、MBC的变化,K-B纸片扩散法验证亚胺培南的耐药性;qRT-PCR检测blaNDM-1基因表达的变化;96孔板法检测3株细菌经亚胺培南诱导前后的总蛋白的活性;诱导表达纯化NDM-1蛋白并检测其活性;SDS-PAGE电泳检测亚胺培南诱导K.pneumoniae TH-P12158的NDM-1蛋白的变化。结果:1.本研究共从NCBI数据库查阅来自国内外携带blaNDM-1质粒的菌株18株,blaNDM-1质粒携带Ambler分类中的A类β-内酰胺酶基因bla SHV、bla TEM和bla CTX的比率为77.78%、B类（包括blaNDM-1）的比率为100%、C类bla CMY和bla DHA的比率为33.33%和D类bla OXA的比率为38.89%。2.K.pneumoniae（n=20）和E.coli（n=20）对头孢菌素类药物的耐药率较高,如头孢唑（第一代）分别为35%（n=7）和75%（n=15）,头孢呋辛（第二代）分别为40%（n=8）和70%（n=14）,头孢曲松（第三代）分别为30%（n=6）和70%（n=14）,头孢吡肟（第四代）分别为15%（n=3）和60%（n=12）。对β-内酰胺酶抑制剂也表现出一定的耐受性;bla SHV、bla TEM-1和bla CTX-M-9在K.pneumoniae中的检出率分别为100%（n=20）、20%（n=4）和70%（n=14）,而在E.coli中的检出率分别为10%（n=2）、35%（n=7）和50%（n=10）,在K.pneumoniae TH-P12158中检测到了blaNDM-1,在K.pneumoniae TH-P12498和E.coli（TH-U3224、TH-U3268、TH-U3226和TH-U3265）中检测出bla IMP。3.亚胺培南诱导blaNDM-1阳性菌株耐药性演变。野生株K.pneumoniae TH-P12158及重组质粒转化菌株E.coli DH5α-blaNDM-1和E.coli BL21（DE3）-blaNDM-1对亚胺培南和美罗培南均敏感。在亚胺培南诱导浓度逐渐递增后,亚胺培南抑制受试菌株的MIC值分别从1×MIC（0.5μg/mL）、1×MIC（0.25μg/mL）和1×MIC（0.25μg/mL）增至16×MIC（8μg/mL）、16×MIC（4μg/mL）和16×MIC（4μg/mL）,MBC值分别从1×MBC（1μg/mL）、1×MBC（1μg/mL）和1×MBC（1μg/mL）增至16×MBC（16μg/mL）、8×MBC（8μg/mL）和8×MBC（8μg/mL）,同时也降低了3株细菌对其它抗生素的敏感性,blaNDM-1的表达均升高,且与亚胺培南的浓度呈正相关。然而,随着亚胺培南浓度的降低或取消,3株细菌的blaNDM-1表达均减弱,而MIC、MBC值保持相对稳定并产生稳定的耐药记忆。蛋白活性检测显示,亚胺培南诱导后的菌株总蛋白及NDM-1蛋白均产生了更有效的水解酶。亚胺培南诱导可以使K.pneumoniae TH-P12158的NDM-1蛋白表达量增多。结论:1.blaNDM-1基因阳性质粒携带有其它β-内酰胺类耐药基因如bla SHV、bla TEM、bla CTX、bla CMY、bla DHA和bla OXA等,这些基因赋予菌株K.pneumoniae和E.coli多重耐药性;2.抗生素暴露促进了敏感细菌的耐药性或耐药性基因表达的发生,耐药基因表达与抗生素暴露之间的正相关性对临床用药有重要的指导意义。