肾阳虚证是肾阳不足的表现,素体阳虚、久病体虚、年老肾亏等生理原因以及经常熬夜、劳累过度、房事频繁等不良生活习惯都会引起肾阳虚,肾阳虚证是慢性肾病、肾衰竭等多种肾系疾病的常见基础证型。调查表明肾阳虚证发病率逐年上升,且日趋年轻化,其家族遗传性使患者身心健康受到严重影响,生活质量急剧下降。对肾阳虚证实质的研究一直是中医研究的重点,也是现代化研究的重点。肾阳虚证是涉及多器官、多系统的整体反应,肾阳虚证本质研究目前主要集中在与神经内分泌免疫系统有关的血液激素、神经递质含量等整体宏观水平的观测上,忽略了对直接受累器官肾脏的研究。同时缺乏细胞内部信号传导、信号通路等分子水平方面的研究。实现中医现代化,更全面地揭示肾阳虚证的本质,需要整体与局部相结合,宏观与微观相结合。肉桂Cinnamomum cassia Presl.是樟科植物肉桂的干燥树皮,始载于《神农本草经》,其味辛、甘、热,归肾、肝、心、脾经,有补火助阳、引火归源、散寒止痛等功效,临床上常作为温补肾阳之品治疗肾阳虚证,如经典方剂右归丸、桂附杜仲汤、金匮肾气丸中均有肉桂。对于肉桂治疗肾阳虚证的研究,多以含肉桂的中药复方为研究对象,药效虽较为显著,但难以证明肉桂在治疗中是否起到关键作用,其体内药效物质也有待进一步确定。本研究拟建立稳定的肾阳虚大鼠模型,分析肉桂多次灌胃给药在肾阳虚大鼠体内外原型和代谢物的积累情况,初步阐明肉桂中可能与其改善肾阳虚作用密切相关的化学物质。再考察肉桂对肾阳虚大鼠症状、下丘脑-垂体-靶腺轴紊乱及肾组织损害的改善作用;基于肉桂对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-靶腺轴功能调控从整体宏观水平揭示肉桂温肾助阳的作用机制;基于肉桂对肾阳虚大鼠肾脏细胞相关凋亡蛋白调控,从分子水平揭示肉桂温肾助阳的作用机制。1 UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析肉桂在肾阳虚大鼠体内移行成分采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS技术考察肉桂多次灌胃肾阳虚大鼠后,其肾脏、血液、尿液、粪便中原型成分和代谢产物。肾阳虚模型大鼠按照1.35 g·kg-1·d-1生药量灌胃肉桂混悬液,连续15 d。末次给药后,收集血浆、尿液、粪便和肾组织样品进行UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析。根据保留时间、相对分子质量、质谱碎片信息以及文献报道,确认样本中原型成分及代谢产物。结果共鉴定出24个成分,3个原型成分,21个代谢产物,包括12个原花青素类、8个木脂素类、2个二萜类、2个有机酸,其中尿液中检出成分最多。肉桂在肾阳虚大鼠体内代谢广泛,代谢途径主要包括甲基化、硫酸化和葡萄糖醛酸化反应。长期给药情况下以原型存在于靶器官和血中的成分很少,推测代谢物发挥药效的可能性较大。2肾阳虚大鼠模型的复制及肉桂对肾阳虚证的改善作用对比空白对照组（CON组）和造模组大鼠肾阳虚证候评分、体质量、肛温及环磷酸腺苷（AMP）、环磷酸鸟苷（GMP）水平验证模型是否稳定可靠。造模失败大鼠被剔除后,将造模组随机分为肾阳虚模型组（MOD组）、低剂量肉桂组（RGL组）、高剂量肉桂组（RGH组）,对比CON组、MOD组、RGL组、RGH组大鼠肾阳虚证候评分、体质量、肛温和自主活动情况,考察肉桂对肾阳虚大鼠症状的改善作用。结果显示,肾阳虚大鼠模型稳定可靠,肉桂能明显改善肾阳虚大鼠体质量降低、肛温降低、自主活动减少等症状。3肉桂对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-靶腺轴的影响及作用机制探究ELISA法测定血浆中下丘脑-垂体-靶腺轴相关激素水平,包括促肾上腺素（ACTH）、皮质酮（CORT）、促甲状腺素（TSH）、三碘甲状腺原氨酸（T3）、四碘甲状腺原氨酸（T4）、睾酮（T）及雌二醇（E2）,称量相关腺体湿重,计算脏器指数,包括下丘脑、垂体、胸腺、肾上腺、甲状腺及睾丸,明确肉桂对肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-靶腺轴调控作用。HE染色法观察相关腺体病理组织形态学改变,包括下丘脑、胸腺、肾上腺、甲状腺及睾丸,聚合酶链式反应（PCR）检测下丘脑促肾上腺激素释放激素（CRH）mRNA、促甲状腺激素释放激素（TRH）mRNA以及促性腺激素释放激素（GnRH）mRNA表达水平,探究肉桂调控肾阳虚大鼠下丘脑-垂体-靶腺轴机制。结果显示,肉桂治疗后,与肾阳虚密切相关的腺体脏器指数和相关激素水平显著回升（P＜0.05）,腺体萎缩症状有所改善,下丘脑和相关腺体病理损伤有所恢复,下丘脑CRHmRNA、TRHmRA和GnRHmRNA表达水平显著回调（P＜0.01）。提示肉桂具有调控下丘脑-垂体-靶腺轴的作用。作用机制可能与恢复下丘脑CRHmRNA、TRHmRA和GnRHmRNA表达水平、修复相关腺体组织形态,进而调控下丘脑-垂体-靶腺轴相关激素水平,缓解相关病理损伤密切相关。4肉桂对肾阳虚大鼠肾组织病理损伤的影响及作用机制探究通过肾脏指数、肾功能指标肌酐（CRE）和尿素氮（BUN）以及肾脏病理切片考察肾阳虚大鼠肾功能及肾脏组织病理损伤情况,原位末端标记法（TUNEL）检测细胞凋亡情况,PCR分析细胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2及Caspases-3 mRNA表达水平,Western blot检测蛋白表达水平,考察肾阳虚大鼠肾脏病理损伤情况并探究肉桂改善其肾组织病理损伤机制。结果显示,与CON组比,肾阳虚大鼠肾脏指数、BUN水平显著升高（P＜0.01）,CRE有升高趋势,肾组织呈现一定程度的病理损伤,细胞凋亡情况更显著,线粒体细胞凋亡途径相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3 mRNA和蛋白表达显著改变（P＜0.01）。经肉桂治疗后,肾组织病理损伤有所恢复,变化的细胞凋亡蛋白表达水平显著回调（P＜0.01）。表明肉桂可以改善肾阳虚大鼠肾功能和肾组织损伤,作用机制可能是通过调控相关凋亡蛋白表达水平,抑制细胞过度凋亡,改善肾组织病理损伤。5总结本课题多次灌胃肾阳虚大鼠肉桂混悬液,从其血浆、尿液、粪便和肾组织样本中共鉴定出24个原型成分及代谢产物,表明肉桂在肾阳虚大鼠体内代谢广泛,代谢物可能为其主要药效成分。成功复制肾阳虚模型,明确肉桂对肾阳虚大鼠症状的改善作用。其机制包括调节下丘脑相关激素mRNA表达水平,缓解下丘脑-垂体-靶腺轴相关腺体病理损伤,调控下丘脑-垂体-靶腺轴功能改善肾阳虚症状。肾脏分子水平研究表明,肉桂通过调控线粒体介导的细胞凋亡途径相关蛋白表达水平,缓解肾组织病理损伤,恢复肾功能,改善肾阳虚证。本课题对阐释肾阳虚本质、肉桂治疗肾阳虚证机制及药效成分具有理论和实际意义,为把肉桂开发为补肾助阳的天然药物提供实验依据。