目的免疫细胞治疗是肿瘤免疫治疗领域中发展迅速和极有前景的方向,其中最为有效的细胞是嵌合抗原受体（chimeric antigen receptor,CAR）基因修饰的T细胞,即CAR-T细胞。CAR是依据抗原抗体识别、细胞活化原理设计并利用基因工程改造的受体。CAR的胞外结构域负责靶细胞识别,通常为直接识别靶细胞抗原的抗体的单链可变区片段（single chain variable fragment,ScFv）;其胞内结构域负责传递活化信号,通常包括CD3ξ链和一个或多个增强效应细胞活化的共刺激结构域。因此CAR-T细胞能以非HLA依赖性方式靶向肿瘤细胞以发挥杀伤功能。CAR-T疗法在血液肿瘤的治疗中取得了巨大进展。自2010年以来,许多实验已证明靶向CD19的CAR-T细胞对CD19阳性的急性淋巴细胞白血病（acute lymphoblastic leukemia,ALL）具有良好的免疫应答,临床治疗的缓解率高达90%。尽管在血液肿瘤中的疗效显著,CAR-T细胞疗法在临床应用中仍然存在不足与挑战。细胞因子释放综合征（Cytokine release syndrome,CRS）是CAR-T细胞在治疗肿瘤过程中最常出现的不良反应,由CAR-T细胞和旁观者免疫细胞的激活释放大量炎症相关细胞因子（如IL-6和IL-1等）触发。CRS的特征包括发热、低血压、毛细血管渗漏综合征、弥散性血管内凝血病和心肺功能衰竭等危及生命的并发症。CAR-T细胞疗法中的安全性问题最引起我们的担忧。肿瘤微环境的免疫抑制是限制CAR-T细胞疗效的另一大挑战。肿瘤细胞通过IL-1、IL-6、IL-10、转化生长因子-β（transforming growth factor-β,TGF-β）、前列腺素E2等细胞因子的产生和分泌来塑造肿瘤微环境,细胞因子可通过募集免疫抑制细胞直接或间接抑制T细胞功能。同时缺氧、低营养成分以及高浓度代谢酸的肿瘤组织微环境能够抑制T细胞正常代谢,导致T细胞无法增殖与分泌细胞因子。此外肿瘤微环境中高表达程序性死亡受体1（programmed death 1,PD1）、细胞毒 T 淋巴细胞相关抗原 4（cytotoxic T lymphocyte-associated antigen-4,CTLA-4）等抑制性受体的配体,可与浸润的T细胞表面的抑制性受体结合进而抑制T细胞功能。骨髓来源的抑制性细胞（myeloid derived suppressor cells,MDSCs）在肿瘤微环境中通过分泌GM-CSF等具有抑制T淋巴细胞免疫作用的物质可增强抑制性肿瘤微环境。MDSCs同时可以借助多种分子通道,使肿瘤组织得以逃脱机体免疫监视,直接或间接地促进肿瘤的生长、侵袭和转移。循环或肿瘤内MDSCs的比例与癌症分期、疾病进展等密切相关。在肝癌、结肠癌、乳腺癌、食道癌等肿瘤中都发现MDSCs含量的增高。因此,靶向MDSCs抗肿瘤治疗策略具有广泛的应用前景。除了 CRS等安全性问题和肿瘤微环境的挑战,CAR结构自身设计的不足也限制了其自身的临床使用。常用的CAR通过ScFv以抗原抗体结合的原理特异性地识别靶细胞抗原,也就意味着每针对一种靶抗原就需要一种与之特异结合的ScFv片段即一种CAR结构。而且,目前大部分的CAR-T细胞都是利用患者自身的T细胞来产生的,属于个体化产物,而患者与患者之间存在个体差异。因此,制备CAR-T细胞是一个昂贵且耗时的过程。这限制了 CAR免疫疗法的临床应用。研发通用型、即用型（off-the-shelf）CAR-T细胞是目前该领域的重要研究方向。NK细胞作为自然杀伤固有免疫淋巴细胞,是机体抗肿瘤的第一道天然防线。相较于T淋巴细胞,对其进行CAR基因修饰应用于免疫治疗具有以下优点。首先,NK细胞被激活后产生的细胞因子类型与T细胞不同。活化的NK细胞通常产生IFN-γ和GM-CSF,而T细胞主要产生促炎细胞因子（如TNF-α、IL-1和IL-6）,因而对NK细胞进行CAR基因修饰可以避免CAR-T细胞临床应用中的细胞因子释放综合症问题。其次,NK细胞除了通过CAR的scFv识别肿瘤相关抗原特异性杀伤靶细胞外,还可以通过多种活化性受体（NKp46、NKp44、NKp30、NKG2D和DNAM1）识别肿瘤细胞在免疫细胞压力下或长期治疗过程中表达的应激性配体杀伤肿瘤细胞。因此,CAR-NK细胞可以通过CAR依赖和NK细胞受体依赖两种机制杀伤肿瘤细胞。最后,同种异体之间转输NK细胞不会引起移植物抗宿主病（graft-versus-host disease,GVHD）,而T细胞具有个体化差异;同时NK细胞可以有外周血、脐带血、胚胎干细胞、细胞系等多种来源,利用NK细胞进行CAR基因修饰可以改善T细胞自体来源的局限性。因此利用NK细胞进行CAR基因修饰具有更高的安全性、更广泛的细胞来源且更易制备成即用型产品用于癌症的免疫治疗。NK细胞的活化与否依赖于活化性受体与抑制性受体信号之间的平衡。NKG2D作为NK细胞活化性受体,其识别广泛的配体。在人类中,NKG2D识别的配体包括 MICA/B 和 UL16 结合蛋白 1-6（UL16-binding proteins 1-6,ULBP1-6）,这些配体在健康人组织细胞表面不存在,而在多种肿瘤细胞表面高表达。因此,构建表达NKG2D的CAR并修饰NK细胞可使CAR-NK细胞广泛识别并杀伤表达NKG2D配体的多种不同的肿瘤细胞。肿瘤组织内部的NK细胞需要面对肿瘤微环境的抑制作用,在肿瘤微环境多种抑制性因素（包括免疫抑制性细胞、抑制性细胞因子和负调分子等）的作用下,肿瘤浸润的NK细胞常常处于耗竭状态,表现为活化性受体（如NKp46和NKG2D）表达下调,抑制性受体（如NKG2A）表达上调,杀伤能力降低。构建NKG2D CAR可以改变肿瘤抑制性微环境引起的NK细胞耗竭。有报道肿瘤内免疫抑制性细胞（如MDSCs）表达NKG2D配体。因此,建立表达NKG2D的CAR-NK细胞进行肿瘤治疗时,一方面可以对NKG2D配体阳性的肿瘤细胞发挥直接的杀伤作用,另一方面,可能通过杀伤NKG2D配体阳性的MDSCs等抑制性细胞而抵抗肿瘤内抑制性微环境的抑制作用。针对以上背景与设想,本研究建立了 NKG2D CAR-NK92细胞系。我们发现NKG2D CAR-NK92细胞对NKG2D配体阳性的肝癌细胞H7402和配体阳性的肿瘤内抑制性细胞MDSCs均有很强的杀伤作用,较未修饰的NK92细胞具有更好的抑制肝癌生长的作用。方法1.用PCR技术和DNA重组技术进行NKG2D CAR载体的构建。2.CAR分子表达的检测:设计跨CD3 ζ和NKG2D片段引物通过PCR技术从基因水平进行检测,用NKG2D抗体通过流式细胞术从蛋白水平进行检测。3.流式细胞术检测NKG2D在NK细胞和NKG2D CAR-NK细胞表面的表达,检测肿瘤细胞NKG2D配体MICA、MICB的表达,检测体外诱导MDSCs CD33、CD14、CD15 及 NKG2D 配体 MICA、MICB 的表达,检测 NKG2D CAR-NK92细胞及NK92细胞杀伤相关分子的表达水平。4.LDH释放法检测NKG2D CAR-NK92细胞及NK92细胞对H7402细胞、SMMC7721细胞及体外诱导MDSCs的杀伤作用。5.酶联免疫吸附实验检测NKG2D CAR-NK92细胞及NK92细分泌IFN-γ的水平。结果1.成功建立了 NKG2D CAR-NK92细胞。2.NKG2D CAR-NK92细胞较NK92细胞对NKG2D配体阳性的肿瘤细胞具有更强的杀伤作用。3.NKG2D CAR-NK92细胞较NK92细胞具有更强的表达杀伤效应分子和细胞因子的功能。4.NKG2D CAR-NK92细胞较NK92细胞对NKG2D配体阳性的H7402肝癌荷瘤小鼠具有更好的治疗效果。5.小鼠肝癌组织含有较高比例的MDSCs。6.NKG2D CAR-NK92细胞较NK92细胞对表达NKG2D配体的MDSCs具有更强的杀伤作用。结论1.NKG2D配体在多种肿瘤细胞表达,NKG2D CAR-NK92细胞较未修饰的NK92细胞对NKG2D配体阳性的肝癌细胞具有更强的杀伤作用,对肝癌异种移植模型有更明显的治疗效果。因此,NKG2D CAR-NK92细胞可作为一种广谱通用型抗肿瘤效应细胞应用于各种NKG2D配体阳性肿瘤的免疫治疗。2.NKG2D CAR-NK92细胞较NK92细胞能够通过杀伤肿瘤微环境中的免疫抑制性细胞MDS纠正肿瘤免疫微环境的抑制性作用,而更好的发挥抗肿瘤作用。