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第一部分缺氧对肝癌细胞免疫微环境及索拉非尼耐药性影响的体外实验研究目的:通过体外细胞实验探讨缺氧对肝癌细胞系Hepa 1-6缺氧诱导因子1α（hypoxia inducible factor-1α,HIF-1α）及程序性死亡配体 1（programmed death-ligand 1,PD-L1）表达的影响;进而探讨Hepa 1-6多药耐药蛋白1（multidrug resistance protein-1,MRP1）在不同缺氧程度及索拉非尼干预后的表达情况。方法:本研究体外细胞实验主要分为两个部分,第一部分是将Hepa 1-6在21%O2和1%O2条件下培养12小时。采用蛋白质印迹法（western blot）和免疫荧光法检测细胞HIF-1α及PD-L1蛋白的表达。第二部分是在21%O2和10%O2、50%O2及1%O2条件下培养Hepa 1-6细胞,同时实验组加入10μM浓度索拉非尼处理细胞12小时后,采用western blot和实时荧光定量PCR检测细胞MRP1蛋白和mRNA的表达。结果:Western blot结果显示和常氧条件相比,Hepa 1-6细胞在缺氧条件下HIF-1α和PD-L1蛋白表达明显升高（P＜0.001）。同样地,免疫荧光结果也显示细胞在缺氧条件下HIF-1α和PD-L1表达显著增加。同时,western blot和PCR结果显示随着缺氧程度的加重,MRP1蛋白和mRNA的表达水平逐渐升高,10μM的索拉非尼干预后,MRP1蛋白和mRNA表达水平进一步升高。结论:缺氧状态下Hepa 1-6肝癌细胞内HIF-1α、PD-L1及MRP1表达上调,可能增加肝癌细胞对索拉非尼的耐药性。第二部分索拉非尼联合PD-L1单抗治疗肝癌的疗效评估及机制探究目的:评估索拉非尼联合PD-L1单抗治疗小鼠Hepa 1-6肝癌模型的疗效,探讨其协同作用机制。方法:将C57BL/6小鼠源性的Hepa 1-6肝癌细胞接种于C57BL/6小鼠（雄性,6-8周龄）右下肢皮下。接种第5-6天待皮下瘤体积生长至80-120mm3时,将小鼠随机分为以下四组:（A）对照组:小鼠Ig G抗体腹腔注射（10 mg/kg）（n=6）;（B）索拉非尼灌胃组（50 mg/kg）（n=6）;（C）PD-L1单抗腹腔注射组（10 mg/kg）（n=6）;（D）联合治疗组:索拉非尼灌胃（50 mg/kg）联合PD-L1单抗腹腔注射（10 mg/kg）（n=6）。干预后第21天对四组小鼠实施安乐死,从皮下完整剥离出肿瘤组织。采用H＆E染色、免疫组织化学染色、免疫荧光染色、流式细胞分析等方法检测四组小鼠皮下瘤微环境变化,同时采用ELISA试剂盒及生化自动分析仪检测四组小鼠血清细胞因子和肝肾功能。此外,为评估各组小鼠生存时间,本研究进行了生存分析。生存分析作为一个独立实验,每组10只小鼠。结果:（1）治疗后第21天,四组小鼠皮下瘤体积分别为A组1563.87±243.84 mm3,B 组 1100.68±198.81 mm3,C 组 491.79±92.44 mm3,D 组 120.51±15.97 mm3（P＜0.001）。生存分析结果显示四组小鼠（A-D组）中位生存时间分别为35天、50天、70天、95天（P＜0.001）。（2）联合治疗组肿瘤坏死率及肿瘤细胞凋亡率最高,肿瘤细胞增殖率最低（P＜0.001）。（3）CD31免疫荧光结果显示B组肿瘤微血管密度显著低于A组（P＜0.001）和C组（P＜0.01）,而与D组无统计学差异（P=0.064）。α-SMA免疫荧光结果显示D组和C组肿瘤周细胞阳性率显著高于A组和B组（P＜0.001）。缺氧荧光染色结果显示B组皮下瘤缺氧面积最大（P＜0.001）。（4）流式分析结果显示D组CD8+T淋巴细胞数量和M1型肿瘤相关巨噬细胞数量显著高于其它三组（P＜0.001）,而M2型肿瘤相关巨噬细胞数量和调节性T细胞数量显著低于其它三组（P＜0.001）。C组和D组小鼠血清IL-12、IFN-γ、颗粒酶B和TNF-α水平高于A组和B组（P＜0.001）,同时C组和D组小鼠血清IL-4和IL-10水平低于B组（P＜0.001）。结论:相较于索拉非尼或PD-L1单抗单药治疗,索拉非尼联合PD-L1单抗能显著抑制肿瘤生长、延长小鼠生存时间。据实验结果推测:PD-L1单抗除了通过增加CD8+T淋巴细胞及M1型肿瘤相关巨噬细胞浸润来改善免疫抑制微环境之外,还可能通过增加肿瘤血管平滑肌层以重塑肿瘤微血管结构来改善缺氧微环境,该效应在联合治疗中可减少肿瘤索拉非尼耐药。第三部分多模态成像在索拉非尼联合PD-L1单抗治疗肝癌早期疗效评估中的作用目的:探讨磁共振（magnetic resonance,MR）和18F-FDG PET/CT多模态成像在索拉非尼联合PD-L1单抗治疗肝癌早期疗效评估中的作用。方法:四组小鼠分组及干预同第二部分实验。四组小鼠在治疗前1天和治疗后第7,14,21天分别进行磁共振T2加权成像（T2WI）、T1mapping、弥散加权成像（diffusion-weighted imaging,DWI）、动态增强 MR（dynamic contrast enhanced,DCE）、MR 波谱（magnetic resonance spectroscopy,MRS）和 18F-FDG PET/CT 扫描,观察及定量分析4个时间点各组小鼠皮下瘤的T2WI表现、T1值、表观弥散系数（apparent diffusion coefficient,ADC）值、血管容量转移常数（Ktrans）值、瘤内乳酸/胆碱比值及肿瘤/肌肉标准化摄取比值（SUV 肿瘤/SUV肌肉）。将上述影像定量结果与第二部分实验中的肿瘤组织H＆E染色、免疫荧光、流式细胞分析结果进行相关性分析。结果:（1）T1mapping定量结果显示治疗前后四组小鼠间皮下瘤T1值无显著差异。（2）DWI定量结果显示治疗前四组小鼠皮下瘤ADC值无统计学差异（P=0.646）。治疗后第7天,D组ADC值显著高于A组（P=0.017）。ADC值与肿瘤细胞坏死率（r=0.810,P＜0.001）、肿瘤细胞凋亡率（r=0.710,P＜0.001）呈正相关,与肿瘤细胞增殖率呈负相关（r=-0.655,P＜0.001）。（3）治疗前,DCE定量结果显示四组小鼠皮下瘤Ktrans值无显著统计学差异（P=0.487）。治疗后第7天,B组Ktrans值显著低于A组（P=0.03）。治疗后第14和第21天,C组和D组Ktrans值显著低于A组（P＜0.01）。肿瘤Ktrans值与肿瘤微血管密度呈正相关（r=0.766,P＜0.01）。（4）治疗前,MRS定量结果显示四组小鼠皮下瘤乳酸/胆碱比值无显著统计学差异（P=0.969）。治疗后B组小鼠皮下瘤乳酸/胆碱比值显著高于A组和C组（P＜0.01）,但与D组相比,无显著统计学差异。乳酸/胆碱比值与肿瘤缺氧面积呈正相关（r=0.898,P＜0.001）。（5）治疗前,18F-FDG PET/CT定量结果显示四组小鼠SUV肿瘤/SUV肌肉比值无显著统计学差异（P=0.978）。治疗后第7天,四组小鼠SUV肿瘤/SUV肌肉比值均升高,但各组间无显著统计学差异（P=0.499）。治疗后第21天,C组和D组由于肿瘤直径显著缩小,两组肿瘤FDG摄取下降。相关性分析显示SUV肿瘤/SUV肌肉比值与CD3+T淋巴细胞数量呈负相关（r=-0.792,P＜0.01）。结论:联合治疗后第7天,肿瘤内ADC值升高和FDG高摄取,反应了肿瘤细胞密度降低及炎症细胞浸润增加。同时,DCE的定量参数Ktrans与MRS的乳酸/胆碱比值揭示了索拉非尼和PD-L1单抗治疗后肿瘤血管和缺氧微环境的早期动态变化。本研究中的影像评估间接检测结果和第二部分动物模型直接检测结果有较好的相关性,为临床应用多模态成像评估抗血管生成药物联合免疫检查点抑制剂治疗肝癌疗效提供了理论依据和实践基础。