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第一部分Gal-9在大鼠脑出血后脑组织中表达水平变化的研究目的:通过建立成年 Sprague-Dawley(SD)大鼠脑出血(Intracerebral Hemorrhage,ICH)模型,检测半乳糖凝集素-9(Galectin-9,Gal-9)在ICH后不同时间点脑组织中的蛋白表达水平变化以及与其结合的TLR-4的水平变化。方法:1.随机选取36只体重在250-300g之间的成年SD大鼠分为假手术(Sham)组、ICH 后 1day 组、ICH 后 3day 组、ICH 后 7day 组、ICH 后 10day 组、ICH 后 14day组,每组6只,分别建立假手术和ICH模型。2.造模成功后的各只大鼠在相应时间点脱颈处死,取得相应脑组织,用蛋白质免疫印迹实验检测Gal-9在ICH之后不同时间点的蛋白表达水平变化;用免疫荧光实验探究表达Gal-9的细胞类型;用免疫共沉淀实验检测ICH后Gal-9与TLR-4的结合水平变化。结果:1.内源性Gal-9蛋白表达水平在ICH发生后开始上升,在ICH发生后第7天达到峰值,之后逐渐下降,但表达水平会维持在较高水平。2.内源性Gal-9蛋白主要表达于小胶质细胞中上,在神经元以及星形胶质细胞中不表达。3.发在ICH生后第7天,当Gal-9的表达水平升高时,与Gal-9结合的TLR-4分子的水平也较Sham组明显增高。结论:ICH后表达于小胶质细胞中的Gal-9水平会升高,与其相结合的TLR-4的水平也明显升高。第二部分探究Gal-9与ICH后中枢神经系统炎症反应以及细胞死亡的关系目的:探究ICH发生后,Gal-9表达水平变化与小胶质细胞各表型之间转换的关系;探究调节Gal-9水平变化后,中枢神经系统相关炎症因子的变化趋势;探究调节Gal-9表达水平变化对大鼠ICH后中枢神经系统细胞死亡的影响。方法:1.随机选取72只SD大鼠分为假手术组(Sham)、脑出血组(ICH)、小干扰RNA阴性对照组(siRNA negative control,Si-NC)、Gal-9 小干扰 RNA 组(Si-Gal-9)、空载组(Vector)、过表达 Gal-9 组(Over-expression-Gal-9,OE-Gal-9),每组 1 2 只。Si-Gal-9组、Si-NC组、OE-Gal-9组、Vector组大鼠分别在侧脑室注射小干扰RNA及其阴性对照试剂、过表达质粒及其对照试剂,48h后6组大鼠分别进行假手术以及ICH造模。2.ICH造模后7天后取得各组大鼠动脉血及脑脊液,通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测各只大鼠血清及脑脊液中炎症因子IL-4和IL-13的水平。3.ICH造模7天后取相应脑组织制作石蜡切片,分别进行免疫荧光染色、TUNEL染色和FJB染色。结果:1.WB和IF实验结果显示:与Vector组相比,过表达质粒转染后提高了 Gal-9的表达水平;与Si-NC组相比,小干扰RNA转染后降低了 Gal-9的表达水平;Si-NC组、Vector组、ICH组的Gal-9表达水平无统计学差异。2.CO-IP结果显示:当Gal-9蛋白表达水平升高时,与Gal-9结合的TLR-4的水平也升高;当Gal-9蛋白表达水平降低时,与Gal-9结合的TLR-4的水平降低。3.ELISA实验结果显示:与Vector组相比,当Gal-9表达水平增高时IL-4、IL-13 的浓度也相应增高;与 Si-NC 组相比,当 Gal-9 表达水平降低时 IL-4、IL-13 的浓度降低;4.小胶质细胞IF实验结果显示:当Gal-9蛋白表达水平增高时,M2型小胶质细胞的数量增多;当Gal-9蛋白表达水平降低时,M2型小胶质细胞的数量减少。5.TUNEL染色和FJB染色结果显示:增加Gal-9蛋白表达可以抑制ICH造成的脑细胞死亡。结论:过表达Gal-9可以促进小胶质细胞转化为M2表型,促进抑炎因子释放,减轻中枢神经系统细胞死亡。第三部分探究在ICH模型下Gal-9对大鼠行为认知能力恢复的影响目的:探究在ICH模型中干预Gal-9蛋白表达水平后对ICH大鼠在行为与认知水平上的影响。方法:1.随机选取60只体重在250-300g之间的成年SD大鼠(8-12周)平均分为假手术组(Sham)、脑出血组(ICH)、小干扰RNA阴性对照组(siRNA negative control,Si-NC)、Gal-9 小干扰 RNA 组(Si-Gal-9)、空载组(Vector)、过表达 Gal-9 组(Over-expression-Gal-9,OE-Gal-9),共6组,每组10只SD大鼠,各组干预及造模方法同第二部分。2.在各组大鼠模型建立后第1天、第3天、第5天、第7天依照神经功能学评分标准对各只大鼠进行评分。在各组大鼠模型建立后第1天、第3天、第5天、第7天、第10天、第14天、第21天、第28天、第35天等时间点分别进行转棒实验以及贴纸实验。在模型建立后第29天、第30天、第31天、第32天、第33天等时间点进行水迷宫实验。结果:1.转棒实验和贴纸实验结果表明:过表达Gal-9组大鼠的运动能力和感觉功能明显优于Vector组大鼠,Si-Gal-9组大鼠运动能力和感觉功能比Si-NC组大鼠更差。2.ICH后大鼠自发性活动、本体感觉、触摸鼻毛、肢体对称性、侧转、前肢伸展、攀爬等行为活动方面逐渐好转,OE-Gal-9组大鼠此七方面行为的恢复速度比Vector组大鼠更快。3.水迷宫实验结果表明,相比于Vector组大鼠,当Gal-9蛋白表达水平增高后,大鼠找到目标平台的时间和游泳距离总体缩短,穿过目标区域的次数和停留在目标象限的时间增加。结论:过表达Gal-9有助于ICH大鼠运动、感觉、学习和记忆能力的恢复。