肺癌是严重威胁人类生命健康的恶性肿瘤之一,具有高发病率和高死亡率。肿瘤的侵袭与转移是影响肺癌病人生存率的重要因素。本实验室前期以基因芯片分析获得中国人肺鳞癌基因表达谱,进而利用生物信息学方法构建了肺癌转移相关共表达分子网络,从中筛选出肺癌相关基因DLK1(Delta-like1himolog)。随后采用实时定量PCR技术(Realtime PCR),在30例肺癌样品中验证了DLK1基因在肿瘤组织中mRNA水平表达升高,体外实验初步显示其促进肺癌细胞转移的生物学功能。本课题承接研究组前期工作,围绕DLK1基因在肺癌中的功能以及其作用机制进行深入研究。首先在较大样本非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中检测DLK1蛋白的表达情况,并分析其临床意义。同时,以人肺癌细胞系为研究对象,通过体外实验对DLK1基因促进肿瘤细胞侵袭的功能研究分析；目的为揭示DLK1基因异常表达调控肺癌发生发展的分子机制。首先,对204例NSCLC患者手术切除组织进行DLK1蛋白免疫组织化学染色,以显示DLK1在肿瘤组织中的表达情况；并结合病例的临床信息,分析DLK1表达水平与疾病分期、肿瘤大小、分化程度,以及淋巴结转移等的关系。结果发现,DLK1蛋白在癌组织中的表达水平显著高于癌旁正常组织,并且与肺鳞癌分期和肿瘤大小显著相关。体外实验主要以肺癌细胞系H1299和A549为研究对象,先利用基因转染和RNA干扰技术,分别构建DLK1基因外源过表达或敲降细胞株。通过体外侵袭实验,分析DLKl基因对肺癌细胞侵袭能力的影响,发现DLK1促进肺癌细胞侵袭。而以qPCR(Realtime quantitative PCR)和Western blot分别分析mRNA和蛋白表达,均表明在肺癌细胞中DLK1基因可以上调侵袭相关蛋白MMP9(Matrix metallaproteins9)的表达；提示DLK1可能作用于Notch信号通路来发挥作用。后续分析证实,DLK1基因的表达影响了细胞内NOTCH1蛋白及其下游效应因子HES1基因的表达水平,说明DLK1基因能够激活Notch信号通路。为探究DLK1基因在NSCLC中异常表达的原因,先后采用qPCR、MSP (Methylation specific PCR),以及亚硫酸测序等技术,分别检测了DLK1基因的拷贝数改变情况、基因印迹情况和启动子区DNA甲基化水平。分析发现,在肺癌组织中,DLK1基因几乎不存在DNA拷贝数改变和印迹缺失情况。DLK1基因启动子区的DNA甲基化水平与DLK1蛋白表达水平呈负相关,DLK1基因异常高表达的肿瘤组织中存在DLK1基因启动子区异常低甲基化。研究结果提示,DLK1基因在NSCLC中的异常表达主要由启动子区DNA甲基化水平降低而引起。由于前述NSCLC免疫组化阅片结果提示,DLK1蛋白有核转位现象,为此我们利用Western blot和激光共聚焦分析技术检测了肺癌细胞内的DLK1蛋白定位情况；首次证实肺癌细胞内存在DLK1蛋白核定位现象。因此,进一步应用Co-IP联合质谱技术寻找DLKl相互作用蛋白,结合生物信息学分析,希望从中获得DLK1蛋白入核的途径及其参与的生物学功能的提示。我们从质谱鉴定数据中筛选出12个具有较高可信度的DLK1相互作用候选蛋白,参与调控包括Notch和NF-κB信号在内的多条信号通路。综上所述,本项研究发现DLK1基因在非小细胞肺癌患者的肿瘤组织中异常高表达；DLK1基因通过激活Notch信号通路,上调MMP9的表达水平,促进肺癌细胞侵袭；DNA甲基化水平异常是造成非小细胞肺癌中DLK1基因表达异常的主要原因；DLK1蛋白在肺癌细胞中具有异常核定位,可能参与细胞分化调控；筛选获得12个潜在的DLK1相互作用蛋白,有待后期验证。