【摘 要】
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目的:牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）是牙周病的主要致病菌之一,其可侵入人类牙龈上皮细胞（human gingival epithelial cells,HGECs）,破坏牙周组织的生态平衡,引起免疫炎症反应。前期研究发现,P.gingivalis感染可诱导永生化的HGECs系epi4细胞自噬。长链非编码RNA（longnon-coding RNA,lncRNA）
【基金项目】
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辽宁省自然科学基金（20180551232）； 沈阳市中青年科技创新人才支持计划项目（RC170078）； 沈阳市科技计划项目（F16-102-4-00）；
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目的:牙龈卟啉单胞菌（Porphyromonas gingivalis）是牙周病的主要致病菌之一,其可侵入人类牙龈上皮细胞（human gingival epithelial cells,HGECs）,破坏牙周组织的生态平衡,引起免疫炎症反应。前期研究发现,P.gingivalis感染可诱导永生化的HGECs系epi4细胞自噬。长链非编码RNA（longnon-coding RNA,lncRNA）TGFB2-OT1在调控细胞自噬方面发挥着一定的作用,可能也和P.gingivalis诱导的epi4细胞自噬相关。本研究检测了 TGFB2-OT1在P.gingivalis感染的epi4细胞内的表达及其对P.gingivalis诱导的epi4细胞自噬的影响,旨在初步探讨P.gingivalis影响HGECs自噬的可能机制,并为牙周疾病自噬相关的抑菌治疗提供新的方向。方法:1、P.gingivalis感染 epi4 细胞（MOI 100:1）0、2、6、12、24、48h后,qRT-PCR法检测TGFB2-OT1 RNA的表达情况。2、利用siRNA体外瞬时转染技术敲低epi4细胞中TGFB2-OT1的表达,实验分三组:空白对照组;阴性对照组,序列打乱的（Scrambled）siRNA转染组;实验组,si-TGFB2-OT1转染组。采用流式细胞技术检测转染6 h后的转染效率并通过qRT-PCR分别在转染24 h、48 h和P.gingivalis感染转染细胞24 h后检测各组细胞内TGFB2-OT1的表达变化。3、按上述分组及选定时间处理细胞,采用Western blot法检测P.gingivalis（MOI 100:1）感染转染后的各组细胞24h后,自噬相关蛋白LC3和P62的表达水平。4、采用LncBook和miRWalk数据库分别预测与TGFB2-OT1和LC3相互作用的miRNA,构建ceRNA网络调控图。通过STRING数据库分析LC3与P62蛋白之间的相互作用关系。结果:1、P.gingivalis感染epi4细胞后,TGFB2-OT1 RNA的表达水平随刺激时间的增加而逐渐升高,在12 h后显著增加,并于24 h时达到峰值,为未感染对照组的2.31倍（P＜0.01）,此后有所下降。2、以100 nM si-TGFB2-OT1体外瞬时转染epi4细胞6 h获得了 76.9%的转染效率;qRT-PCR显示转染后24 h和48 h,与空白对照组和阴性对照组相比,实验组epi4细胞内的TGFB2-OT1均有显著性下降（P＜0.01）,两时间点的阻断效率分别为75%和70%,两者之间无明显差异;P.gingivalis感染实验组epi4细胞24h,qRT-PCR显示TGFB2-OT1水平与未感染实验组相比无显著变化。3、Western blot显示P.gingivalis（MOI 100:1）感染空白对照组与阴性对照组epi4细胞24 h后,LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ均显著升高（P＜0.05）,P62蛋白水平显著下降（P＜0.05）,而实验组无明显改变,且感染后的实验组细胞中LC3 Ⅱ/LC3 Ⅰ显著低于感染后的空白对照组和阴性对照组（P＜0.05）,P62蛋白的相对表达量显著高于两对照组（P＜0.05）。4、生物信息学分析预测了 TGFB2-OT1可能通过ceRNA机制影响LC3蛋白变化的34个miRNA,而LC3蛋白改变带来的自噬流变化将进一步影响P62蛋白的水平。结论:P.gingivalis感染可通过上调lncRNA TGFB2-OT1的表达来促进epi4细胞的自噬水平,为牙周疾病自噬相关的抑菌治疗提供新的思路。
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