前动力蛋白2在不同年龄牦牛睾丸中的表达定位及其在支持细胞炎性模型中的作用

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前动力蛋白2(Prokineticin 2,PK2)在哺乳动物生殖器官生长发育及维持正常哺乳动物的繁育能力中具有重要的作用,且PK2可以诱导相应免疫细胞活化并激活其中的PK2受体调节释放炎性细胞因子,调节免疫过程。为探究PK2在牦牛睾丸中的生物学功能,本研究采集牦牛不同时期睾丸(幼年期、性成熟初期、性成熟后期、老年期),通过实时荧光定量PCR(quantitative Real-time PCR,q RT-PCR)、免疫组织化学(Immunohistochemistry,IHC)和蛋白质免疫印迹(Western-blot,WB)等方法对牦牛PK2基因和蛋白在不同时期睾丸上的表达水平进行检测和定位。经脂多糖(LPS)作用于睾丸支持细胞构建牦牛睾丸炎的炎症模型,并以不同浓度(0M、10-9M、10-11M、10-13M)PK2蛋白作用,采用q RT-PCR和Western Blotting等方法检测PK2蛋白的促炎作用。结果如下:(1)在牦牛不同发育阶段的睾丸中,PK2 m RNA在性成熟后期及老年期的表达量显著高于幼年期和性成熟初期,幼年期和性成熟初期二者、性成熟后期和老年期之间无显著差异;PK2蛋白在牦牛不同时期睾丸均表达,主要成熟精子中表达,其次是在初级精母细胞、次级精母细胞及圆形精子细胞中,而且PK2蛋白在幼年期的表达量最低,显著低于表达量无显著性差异的性成熟初期、性成熟后期及老年期。(2)成功分离提纯与培养牦牛睾丸支持细胞,利用免疫细胞化学技术鉴定细胞,该细胞表达Fasl蛋白;利用福尔根染色技术鉴定细胞,该细胞内具有明显卫星小体,确定其为较纯的SCs细胞。确定其为较纯的SCs细胞。采用不同浓度(0、0.1、1、10μg/m L)LPS处理牦牛睾丸支持细胞24 h后,依据其细胞抑制率及细胞形态变化确定其最终浓度为0.1μg/m L,即其炎症模型构建成功。(3)不同浓度(0 M、10-9M、10-11M、10-13M)PK2蛋白作用于LPS构建的牦牛睾丸支持细胞炎症模型后发现,PK2蛋白在浓度为10-11M时具有最显著的促进白细胞介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表达并抑制白细胞介素10(Interleukin-10,IL-10)的表达,且在浓度为10-13M时不促进或抑制IL-1β或IL-10表达;肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)基因及蛋白在PK2处理组中的表达量之间无显著差异。结果表明,在牦牛睾丸中PK2广泛存在,且不同时期睾丸上的表达水平存在差异,分布位置除幼年期外无明显变化。0.1μg/m L LPS于睾丸支持细胞作用24 h后成功构建炎性模型,且在该模型中添加10-11和10-9M浓度PK2蛋白时起到促炎作用。本次研究提示推测PK2可能参与牦牛睾丸的发育、精子细胞的发育和成熟等过程,而且其极大可能是通过参与炎性反应在其中发挥作用,这为后期研究其在睾丸功能方面提供基础研究。
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