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氧苯酮（Benzophenone-3,BP3）作为防晒霜的主要成分随着其广泛使用已在环境介质、生物体和人体中普遍检出，对生态环境和人群健康造成了一定的风险。人群检测数据表明BP3不仅存在于人体的尿液和血液，在乳汁、胎盘和脑组织中也广泛存在，表明其对婴幼儿可能存在潜在的神经发育毒性。因其化学结构与雌激素相类似，现有的相关研究大多集中在BP3雌激素效应及抗雄激素活性评价，对BP3的神经行为毒性研究鲜有报道，仅有的少数神经毒性方面的研究则主要集中在体外的细胞实验。模式生物斑马鱼因具有体型小、胚胎透明、体外受精、遗传信息与哺乳动物高度同源等优势，已广泛应用于环境毒理学领域。其胚胎期的神经系统对环境污染物的影响尤为敏感，非常适合用于研究化合物的神经发育毒性。本文以斑马鱼为模式生物，系统地研究了（1）低剂量环境浓度BP3在胚胎发育敏感窗口急性暴露对斑马鱼幼鱼的神经行为毒性效应/作用机制及幼鱼后期发育对BP3的敏感性；及（2）低剂量环境浓度BP3全生命阶段长期慢性暴露对雌雄成鱼的神经行为毒性及其潜在的毒性作用机制。本研究拟通过系统研究BP3的神经行为毒性来评价BP3对生态环境及人群健康的影响，研究结果将为生态风险评价以及环境保护，污染控制决策提供一定的科学依据。
第一章主要研究BP3在胚胎发育敏感窗口暴露对幼鱼的急性神经毒性。首先，采用了三种运动行为学指标筛选出了BP3作用于斑马鱼产生神经行为毒性的最佳效应浓度（10μg/L）和敏感暴露时间窗口（6-24hourpost fertilization，hpf）。然后通过敏感窗口期暴露来进一步检测BP3作用于斑马鱼的运动行为、社会行为、形态学和分子生物学等相关指标。神经行为实验的研究结果显示BP3敏感窗口暴露改变了19-27hpf斑马鱼自主运动次数，降低了27hpf时斑马鱼对外界刺激的反应能力，增加了5dpf(dayspostfertilization,dpf)时斑马鱼在黑暗条件下的运动速度，增加了11dpf幼鱼Shoaling的离散度，降低了12dpf镜面反应中的镜面攻击次数和在镜面区域滞留时间百分比等行为学指标。对初级运动神经元的研究表明BP3敏感窗口暴露抑制了27hpf斑马鱼幼鱼运动神经元轴突的生长，但对48hpf幼鱼的运动神经元轴突并无影响。对5dpf幼鱼神经轴突相关基因的表达分析显示BP3敏感窗口暴露诱导髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，mbp）和生长相关蛋白43（growth associated protein43，gap43）的超表达。对肌肉纤维的形态学研究发现BP3敏感窗口暴露对斑马鱼在5dpf的肌肉纤维形态并无影响。对细胞增殖和凋亡的研究显示BP3敏感窗口暴露降低了24hpf斑马鱼胚胎头部区域细胞的增殖，并在此同时诱导增加了头部区域细胞的凋亡。在转录水平上，增加了凋亡因子Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associated X，bax）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase3，caspase-3）的mRNA表达；以及与凋亡相关的维甲酸X受体（Retinoid xreceptor，Rxrgb）的显著超表达。考虑到BP3有可能通过Rxrgb受体诱导神经细胞凋亡从而引发神经行为毒性，接着采用morpholino下调Rxrgb受体来测试这一假说。研究发现，Rxrgb受体下调在一定程度上挽救了BP3敏感窗口暴露诱发的一系列神经行为表型，如27hpf时神经轴突长度，触摸反应，光暗刺激，集群行为，镜面反应及细胞凋亡。这些结果表明低剂量环境浓度BP3在胚胎发育敏感窗口暴露对斑马鱼存在神经行为毒性效应，且这种效应是通过Rxrgb受体介导的。
第二章主要探索BP3在胚胎发育敏感窗口暴露是否会影响后期幼鱼对BP3重新暴露的耐受性和敏感性。利用光暗刺激和镜面反应这两种较为敏感的行为学指标来进行测试。通过检测斑马鱼在光照和黑暗条件下的平均运动距离、镜面攻击次数和在镜面区域滞留时间百分比等指标，发现胚胎期受过BP3暴露的幼鱼在重新暴露于BP3（100μg/L，4hours）后其在黑暗条件下较对照组平均运动距离增多；每分钟的镜面平均攻击次数较对照组减少，在镜面区域滞留时间百分比也较对照组减少。这一结果表明BP3胚胎发育敏感窗口暴露降低了斑马鱼幼鱼行为改变的阈值并增加了斑马鱼幼鱼对BP3急性暴露的敏感性。
第三章主要研究BP3全生命阶段长期慢性暴露对斑马鱼雌雄成鱼的神经行为毒性效应。模拟现实环境中生物及人群的长期慢性暴露状况，以低剂量环境浓度BP3（10μg/L）对斑马鱼进行为期5个月的全程暴露，染毒结束后，对斑马鱼雌/雄鱼分别进行神经运动行为相关指标的检测，具体指标包括镜面反应、社会偏好和T型迷宫。研究发现，BP3对斑马鱼的存活率，畸形率，性别比例，体长和体重没有明显的影响，但是抑制了斑马鱼雌性成鱼脑的生长发育（脑重/体重）。成鱼镜面反应行为学分析发现，BP3对雌/雄成年斑马鱼在镜面区域滞留时间无影响，但显著降低了雌性斑马鱼的镜面攻击次数；社会偏好行为学分析发现，BP3显著降低了雌/雄斑马鱼在近侧区域的时间百分比和距离百分比。T型迷宫行为学分析发现，BP3暴露组雌/雄斑马鱼前往奖赏区域方向的正确率降低，同时BP3暴露组雌性斑马鱼到达奖赏区域所需要的时间延长，表明BP3长期慢性暴毒损伤了斑马鱼特别是雌鱼的空间记忆能力。此外，对脑组织神经递质的定量分析表明BP3对雌/雄斑马鱼脑内乙酰胆碱酯酶的含量没有影响，但显著降低了雌性斑马鱼脑内多巴胺的含量。Edu免疫荧光实验结果发现，雌/雄斑马鱼中BP3暴露组端脑区域Edu阳性细胞数较对照组降低，表明BP3慢性暴露降低了成年斑马鱼端脑区域细胞的增殖。TUNEL染色结果发现，雌性斑马鱼中BP3暴露组端脑区域TUNEL阳性细胞数增多，表明BP3诱导了雌性斑马鱼端脑区域细胞的凋亡。基因和蛋白的表达分析也显示BP3显著上调了雌性斑马鱼脑部caspase-3和bax/bcl-2的表达，再次印证了BP3慢性暴露诱发雌性斑马鱼端脑区域细胞凋亡的结果。综上所述，我们的研究结果表明BP3长期慢性暴露所诱导的神经行为毒性主要体现在雌性成鱼，故而具有显著的性别效应。
第四章主要探索BP3全生命阶段长期慢性暴露对斑马鱼雌性成鱼神经行为毒性的内在分子作用机制。为了进一步深入研究BP3长期慢性暴露对雌性斑马鱼神经行为毒性的潜在分子机制，本章节利用全基因组测序（RNA-seq）技术，对BP3暴露组和对照组的雌性斑马鱼脑组织进行转录组测序分析。通过对比处理组和对照组脑组织基因表达的差异，GO和KEGG富集分析了BP3参与的生物学过程和信号通路。差异基因GO富集分析发现，差异基因分别参与生物或细胞的多种生物过程。其中，在生物学进程方面，主要包括DNA复制的负性调控、细胞大分子生物合成过程的调控、细胞生物合成过程的调控、内耳发育和对化学物品的反应等。在细胞组分方面，主要包括MICOS复合体和血红蛋白复合体。在分子功能方面，主要包括缝隙连接通道活性、己糖激酶活性、缺氧、氧载活性和磷酸脂肌醇二磷酸磷酸酶活性。差异基因KEGG信号通路富集分析发现，差异表达的基因主要富集于HIF-1信号通路、病毒感染通路、嘌呤代谢、激素代谢、昼夜节律等信号通路。
综上所述，本论文研究发现低剂量环境浓度BP3在胚胎发育敏感窗口急性暴露对斑马鱼幼鱼存在显著的神经行为毒性效应，且这种效应是通过Rxrgb受体介导的。同时，BP3胚胎期敏感窗口暴露降低了斑马鱼幼鱼行为改变的阈值并增加了后期幼鱼对BP3急性暴露的敏感性。此外，低剂量环境浓度BP3长期慢性暴露同样具有显著的神经行为毒性效应，但这一效应主要体现在雌性成鱼。脑组织的全基因组测序分析揭示了BP3影响雌性斑马鱼神经行为毒性的一些主要信号通路。我们的研究结果显示BP3在现有的环境浓度范围内不管是急性（敏感窗口）或慢性暴露对水生生物都具有显著的神经行为毒性效应，说明BP3对生态环境和人群健康具有很高的风险。
第一章主要研究BP3在胚胎发育敏感窗口暴露对幼鱼的急性神经毒性。首先，采用了三种运动行为学指标筛选出了BP3作用于斑马鱼产生神经行为毒性的最佳效应浓度（10μg/L）和敏感暴露时间窗口（6-24hourpost fertilization，hpf）。然后通过敏感窗口期暴露来进一步检测BP3作用于斑马鱼的运动行为、社会行为、形态学和分子生物学等相关指标。神经行为实验的研究结果显示BP3敏感窗口暴露改变了19-27hpf斑马鱼自主运动次数，降低了27hpf时斑马鱼对外界刺激的反应能力，增加了5dpf(dayspostfertilization,dpf)时斑马鱼在黑暗条件下的运动速度，增加了11dpf幼鱼Shoaling的离散度，降低了12dpf镜面反应中的镜面攻击次数和在镜面区域滞留时间百分比等行为学指标。对初级运动神经元的研究表明BP3敏感窗口暴露抑制了27hpf斑马鱼幼鱼运动神经元轴突的生长，但对48hpf幼鱼的运动神经元轴突并无影响。对5dpf幼鱼神经轴突相关基因的表达分析显示BP3敏感窗口暴露诱导髓鞘碱性蛋白（myelin basic protein，mbp）和生长相关蛋白43（growth associated protein43，gap43）的超表达。对肌肉纤维的形态学研究发现BP3敏感窗口暴露对斑马鱼在5dpf的肌肉纤维形态并无影响。对细胞增殖和凋亡的研究显示BP3敏感窗口暴露降低了24hpf斑马鱼胚胎头部区域细胞的增殖，并在此同时诱导增加了头部区域细胞的凋亡。在转录水平上，增加了凋亡因子Bcl-2相关X蛋白（Bcl-2associated X，bax）和含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3（cysteinyl aspartate specific proteinase3，caspase-3）的mRNA表达；以及与凋亡相关的维甲酸X受体（Retinoid xreceptor，Rxrgb）的显著超表达。考虑到BP3有可能通过Rxrgb受体诱导神经细胞凋亡从而引发神经行为毒性，接着采用morpholino下调Rxrgb受体来测试这一假说。研究发现，Rxrgb受体下调在一定程度上挽救了BP3敏感窗口暴露诱发的一系列神经行为表型，如27hpf时神经轴突长度，触摸反应，光暗刺激，集群行为，镜面反应及细胞凋亡。这些结果表明低剂量环境浓度BP3在胚胎发育敏感窗口暴露对斑马鱼存在神经行为毒性效应，且这种效应是通过Rxrgb受体介导的。
第二章主要探索BP3在胚胎发育敏感窗口暴露是否会影响后期幼鱼对BP3重新暴露的耐受性和敏感性。利用光暗刺激和镜面反应这两种较为敏感的行为学指标来进行测试。通过检测斑马鱼在光照和黑暗条件下的平均运动距离、镜面攻击次数和在镜面区域滞留时间百分比等指标，发现胚胎期受过BP3暴露的幼鱼在重新暴露于BP3（100μg/L，4hours）后其在黑暗条件下较对照组平均运动距离增多；每分钟的镜面平均攻击次数较对照组减少，在镜面区域滞留时间百分比也较对照组减少。这一结果表明BP3胚胎发育敏感窗口暴露降低了斑马鱼幼鱼行为改变的阈值并增加了斑马鱼幼鱼对BP3急性暴露的敏感性。
第三章主要研究BP3全生命阶段长期慢性暴露对斑马鱼雌雄成鱼的神经行为毒性效应。模拟现实环境中生物及人群的长期慢性暴露状况，以低剂量环境浓度BP3（10μg/L）对斑马鱼进行为期5个月的全程暴露，染毒结束后，对斑马鱼雌/雄鱼分别进行神经运动行为相关指标的检测，具体指标包括镜面反应、社会偏好和T型迷宫。研究发现，BP3对斑马鱼的存活率，畸形率，性别比例，体长和体重没有明显的影响，但是抑制了斑马鱼雌性成鱼脑的生长发育（脑重/体重）。成鱼镜面反应行为学分析发现，BP3对雌/雄成年斑马鱼在镜面区域滞留时间无影响，但显著降低了雌性斑马鱼的镜面攻击次数；社会偏好行为学分析发现，BP3显著降低了雌/雄斑马鱼在近侧区域的时间百分比和距离百分比。T型迷宫行为学分析发现，BP3暴露组雌/雄斑马鱼前往奖赏区域方向的正确率降低，同时BP3暴露组雌性斑马鱼到达奖赏区域所需要的时间延长，表明BP3长期慢性暴毒损伤了斑马鱼特别是雌鱼的空间记忆能力。此外，对脑组织神经递质的定量分析表明BP3对雌/雄斑马鱼脑内乙酰胆碱酯酶的含量没有影响，但显著降低了雌性斑马鱼脑内多巴胺的含量。Edu免疫荧光实验结果发现，雌/雄斑马鱼中BP3暴露组端脑区域Edu阳性细胞数较对照组降低，表明BP3慢性暴露降低了成年斑马鱼端脑区域细胞的增殖。TUNEL染色结果发现，雌性斑马鱼中BP3暴露组端脑区域TUNEL阳性细胞数增多，表明BP3诱导了雌性斑马鱼端脑区域细胞的凋亡。基因和蛋白的表达分析也显示BP3显著上调了雌性斑马鱼脑部caspase-3和bax/bcl-2的表达，再次印证了BP3慢性暴露诱发雌性斑马鱼端脑区域细胞凋亡的结果。综上所述，我们的研究结果表明BP3长期慢性暴露所诱导的神经行为毒性主要体现在雌性成鱼，故而具有显著的性别效应。
第四章主要探索BP3全生命阶段长期慢性暴露对斑马鱼雌性成鱼神经行为毒性的内在分子作用机制。为了进一步深入研究BP3长期慢性暴露对雌性斑马鱼神经行为毒性的潜在分子机制，本章节利用全基因组测序（RNA-seq）技术，对BP3暴露组和对照组的雌性斑马鱼脑组织进行转录组测序分析。通过对比处理组和对照组脑组织基因表达的差异，GO和KEGG富集分析了BP3参与的生物学过程和信号通路。差异基因GO富集分析发现，差异基因分别参与生物或细胞的多种生物过程。其中，在生物学进程方面，主要包括DNA复制的负性调控、细胞大分子生物合成过程的调控、细胞生物合成过程的调控、内耳发育和对化学物品的反应等。在细胞组分方面，主要包括MICOS复合体和血红蛋白复合体。在分子功能方面，主要包括缝隙连接通道活性、己糖激酶活性、缺氧、氧载活性和磷酸脂肌醇二磷酸磷酸酶活性。差异基因KEGG信号通路富集分析发现，差异表达的基因主要富集于HIF-1信号通路、病毒感染通路、嘌呤代谢、激素代谢、昼夜节律等信号通路。
综上所述，本论文研究发现低剂量环境浓度BP3在胚胎发育敏感窗口急性暴露对斑马鱼幼鱼存在显著的神经行为毒性效应，且这种效应是通过Rxrgb受体介导的。同时，BP3胚胎期敏感窗口暴露降低了斑马鱼幼鱼行为改变的阈值并增加了后期幼鱼对BP3急性暴露的敏感性。此外，低剂量环境浓度BP3长期慢性暴露同样具有显著的神经行为毒性效应，但这一效应主要体现在雌性成鱼。脑组织的全基因组测序分析揭示了BP3影响雌性斑马鱼神经行为毒性的一些主要信号通路。我们的研究结果显示BP3在现有的环境浓度范围内不管是急性（敏感窗口）或慢性暴露对水生生物都具有显著的神经行为毒性效应，说明BP3对生态环境和人群健康具有很高的风险。