研究背景重金属可以通过人类的生产生活或者自然运动进入环境中,从而对整个生态系统产生影响。铅和镉均能被人体吸收并蓄积在体内,对机体多个系统产生危害。目前,关于重金属的研究主要集中在单个重金属暴露的毒性上,而铅镉复合暴露的毒性尚不明确。生物钟在生命活动中起到重要的调节作用。生物钟的节律性通过生物钟基因及其蛋白产物所构成的转录/翻译负反馈调控环路所维持,包括核心环路和旁路。铅镉复合暴露对生物钟的影响以及其作用机制尚不清楚。本研究通过观察低浓度铅镉复合暴露对斑马鱼行为昼夜节律的影响以及斑马鱼生物钟基因的表达改变,为更加全面地了解铅镉联合毒性提供新的思路。研究方法1.观察不同时间点的铅镉复合暴露对斑马鱼胚胎/幼鱼死亡率和畸形率的影响。2.利用ViewPoint行为学分析仪检测不同时间点的铅镉复合暴露对斑马鱼胚胎/幼鱼的运动能力的影响。3.观察铅镉单独暴露和复合暴露对斑马鱼自主抽动、心率、孵化率、死亡率和畸形率的影响。4.采用吖啶橙（AO）染色法观察铅镉单独暴露和复合暴露对3dpf斑马鱼神经细胞凋亡的影响。5.采用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）检测铅和镉在斑马鱼体内的蓄积量。6.分别检测铅镉单独暴露和复合暴露对5dpf幼鱼的30min明暗交替和24h昼夜行为的影响。7.观察褪黑素对铅镉单独暴露以及复合暴露毒性效应的影响。8.通过qRT-PCR检测铅镉单独暴露和复合暴露对褪黑素合成限速酶（aanatl和aanat2）的影响。9.观察铅镉单独暴露和复合暴露对褪黑素受体（mtnr1al、1aa、1ba、1bb和1c）的影响。10.检测铅镉单独暴露和复合暴露对生物钟基因的影响。研究结果1.在不同时间点使用低浓度铅（0.05μmol/l）镉（0.045μmol/l）对斑马鱼胚胎/幼鱼进行复合暴露,4hpf复合暴露组畸形率最高,运动能力最低。2.与对照组相比,铅镉复合暴露组的畸形率（卵黄囊/心包水肿和脊柱弯曲）达到35.3%。铅和镉单独暴露组的畸形率分别为9.1%和23.1%。3.通过30min明暗交替实验,发现无论是铅镉单独暴露还是复合暴露均可显著降低5dpf幼鱼的运动能力,同时镉单独暴露和铅镉复合暴露能降低幼鱼对光刺激的反应性。4.AO染色结果表明铅镉单独或者复合暴露不会升高幼鱼的凋亡水平。5.ICP-MS结果表明斑马鱼吸收铅和镉的过程存在拮抗作用。6.通过24h昼夜行为实验发现,与对照组相比,镉暴露组在夜间的每小时运动距离显著增强,昼夜每小时运动距离相近,昼夜行为节律紊乱;铅镉复合暴露组仅在白天的每小时运动距离显著低于对照组,昼夜行为节律受损;铅暴露组昼夜每小时运动距离均显著低于对照组,但仍保持原有的昼夜行为节律。7.褪黑素不能恢复镉暴露组以及铅镉复合暴露组的昼夜行为节律。8.铅镉复合暴露使aanat1的表达节律紊乱。9.铅、镉暴露组的褪黑素受体mtnr1c的表达水平显著上升,铅镉复合暴露组的褪黑素受体mtnr1aa和1bb的表达水平显著下降。10.镉暴露使clock1b、clock2和cry1b的表达节律紊乱,而铅镉复合暴露使clock2的表达节律紊乱。研究结论低浓度铅镉复合暴露能导致斑马鱼幼鱼畸形率升高,同时降低其运动能力。镉单独暴露以及铅镉复合暴露均可能引起幼鱼的昼夜行为节律异常,这种异常可能与褪黑素相关分子及生物钟基因表达改变有关。