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摘 要：目的：建立同时测定脑得生片中三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、Re、Rb1含量的方法。方法：采用反相高效液相色谱法，Apollo C18-A柱(5 μm，250mm×4.6mm)，以乙腈-水为流动相，梯度洗脱，流速1.0mL·min-1，柱温30℃，检测波长为203nm。结果：三七中三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1，4种成分在60min内可达到良好分离，在测定范围内线性良好，回收率在98%～102%之间。结论：所建立的含量测定方法简便可行，重复性好，可用于脑得生片的质量控制。
关键词：三七；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rb1；三七皂苷R1；RP-HPLC
中图分类号：R927.2 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)05-038-03
脑得生片收载于《中国药典》2005年版(一部)，是由三七、红花、葛根、川芎、山楂5味药材制成的中药复方制剂，具有活血化淤、疏通经络、醒脑开窍等功效。临床用于脑动脉硬化、缺血性脑中风及脑出血后遗症等。三七为该方主药，含有多种三七皂苷及人参皂苷成分[1]，有关采用HPLC法测定三七药材及制剂中多种皂苷的方法已有报道[2，3]。本实验采用反相高效液相色谱法，以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1，4种皂苷成分作为该制剂的同步定量测定指标，能更有效地控制制剂的质量。
1 仪器与试药
shimadzuLC-10Atvp型高效液相色谱仪，shimadzu SPD-10Avp型紫外检测器，N3000色谱工作站，AY120SHIMADZU分析天平；人参皂苷Rg1(110703-200322)、人参皂苷Rb1(110704-200318)、人参皂苷Re(110754-200319)和三七皂苷R1(110745-200312)对照品(中国药品生物制品检定所)，脑得生片样品(自制)，乙腈为色谱纯(CaledonLaboratoriesLTD.)，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Apollo5u C18-A(250mm×4.6mm)；流动相：A(乙腈)-B(水)，梯度洗脱，0～15 min(19%A，81%B)，15～40min(19%A～25%A，81%B～75%B)，40～70min (25%A～50%A，75%B～50%B)；流速：1.0mL·min-1；检测波长203nm；柱温30℃；进样量10μL。HPLC图见图1，三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1在上述色谱条件下与其他成分实现了基线分离。
2.2 对照品溶液的制备
分别称取三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品各5 mg、10mg、5mg、10mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成含三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re分别为0.260mg·mL-1、0.412 mg·mL-1、0.420mg·mL-1、0.204 mg·mL-1的混合对照液。
2.3 三七药材对照液的制备
取三七粉末(过四号筛)0.6 g，精密称定，加入甲醇50mL，称定重量，放置过夜，置80℃水浴上保持微沸2h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。
2.4 供试品溶液及阴性对照液的制备
取本品20片，精密称定，研细，取约1g，精密称定，加入甲醇15mL，称定重量，置水浴上回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。同法制得三七的阴性对照液。
2.5 方法学考察
①线性关系考察：分别精密吸取上述混合对照溶液2、4、6、12、16、20(μL)，分别注入高效液相色谱仪中，测定其峰面积，并以对进样量(X，μg)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标进行线性回归处理，回归方程分别为：
三七皂苷R1：Y=1.6220×105X+2.7527×103(r=0.9997)；人参皂苷Rg1：Y=1.9604×105X-2.8334×103(r=0.9999)；人参皂苷Re：Y=1.4266×105X+5.3408×103(r=0.9993)；人参皂苷Rb1：Y=1.5235×105X+1.6954×103(r=0.9999)。
结果表明，三七皂苷R1在0.520～5.20μg范围内具有良好的线性关系；人参皂苷Rg1在0.824～8.24μg范围内具有良好的线性关系；人参皂苷Re在0.408～4.08μg范围内具有良好的线性关系；人参皂苷Rb1在0.840～8.40μg范围内具有良好的线性关系。
②精密度试验：精密吸取上述混合对照溶液与供试样品液10μL，分别连续进样6次，在上述色谱条件下测定4种组分的峰面积积分值，结果对照品的三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的RSD分别为2.51%、1.42%、1.97%、1.38%，供试样品液的三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的RSD分别为2.82%、1.03%、1.35%、1.81%。
③重复性试验：取同一样品，按供试品溶液制备方法制备6份供试样品液，进样测定，记录峰面积，测定结果得三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的RSD分别为2.46%、1.53%、1.68%、1.86%。
图1 HPLC图
A对照品 B三七药材 C样品 D阴性样品
1-三七皂苷R1 2-人参皂苷Rg1 3-人参皂苷Re 4-人参皂苷Rb1
④稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24h进样测定，结果三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的峰面积的RSD分别为1.16%、1.04%、1.34%、1.55%，表明待测成分在24h内稳定。
⑤加样回收率试验：精密称取已知含量的脑得生样品6份，每份分别精密加入三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品适量，按照供试品溶液制备方法进行操作并测定，计算回收率，结果见表1~4。
⑥样品测定：取不同批次脑得生片样品，按2、4项下操作制备供试品溶液各三份，按上述液相色谱条件进样进行分析测定，结果见表5。
3 讨论
本实验在色谱条件选择时，比较了多种流动相的梯度条件，最后确定的流动相梯度条件能使三七药材和制剂处方中三七的四种成分都达到有效分离。在实验过程中，发现较难分离的主要是人参皂苷Rg1与人参皂苷Re，因此在设计梯度条件时应充分考虑对人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离效果，同时考虑复方中其他成分的干扰。经实验证实，该方法稳定、可靠、分离效果良好，可用于该制剂的质量控制。
从所得的色谱图中发现，保留时间63min处的色谱峰为三七药材中的一个特征峰，并经初步验证该峰为人参皂苷Rd，可为三七中五种皂苷成分的测定及指纹图谱研究提供色谱条件的参考。
参考文献：
[1] 刘刚，鲍建材，郑友兰.三七的化学成分研究进展[J].人参研究，2004，(2)：10~17.
[2] 沈国芳，吴永江，程翼宇.RP-HPLC测定血栓通注射液中4种皂苷的含量[J].中国药学，2003，38(9)：698~699.
[3] 杨雪梅，刘 旭，刘艳山，等.高效液相色谱法测定三七中三七皂苷R1及人参皂苷Rg1，Rb的含量[J].时珍国医国药，2005，16(8)：710.
(责任编辑：陈涌涛)
关键词：三七；人参皂苷Rg1；人参皂苷Re；人参皂苷Rb1；三七皂苷R1；RP-HPLC
中图分类号：R927.2 文献标识码：A 文章编号：1673-2197(2008)05-038-03
脑得生片收载于《中国药典》2005年版(一部)，是由三七、红花、葛根、川芎、山楂5味药材制成的中药复方制剂，具有活血化淤、疏通经络、醒脑开窍等功效。临床用于脑动脉硬化、缺血性脑中风及脑出血后遗症等。三七为该方主药，含有多种三七皂苷及人参皂苷成分[1]，有关采用HPLC法测定三七药材及制剂中多种皂苷的方法已有报道[2，3]。本实验采用反相高效液相色谱法，以人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1及三七皂苷R1，4种皂苷成分作为该制剂的同步定量测定指标，能更有效地控制制剂的质量。
1 仪器与试药
shimadzuLC-10Atvp型高效液相色谱仪，shimadzu SPD-10Avp型紫外检测器，N3000色谱工作站，AY120SHIMADZU分析天平；人参皂苷Rg1(110703-200322)、人参皂苷Rb1(110704-200318)、人参皂苷Re(110754-200319)和三七皂苷R1(110745-200312)对照品(中国药品生物制品检定所)，脑得生片样品(自制)，乙腈为色谱纯(CaledonLaboratoriesLTD.)，水为重蒸水，其余试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Apollo5u C18-A(250mm×4.6mm)；流动相：A(乙腈)-B(水)，梯度洗脱，0～15 min(19%A，81%B)，15～40min(19%A～25%A，81%B～75%B)，40～70min (25%A～50%A，75%B～50%B)；流速：1.0mL·min-1；检测波长203nm；柱温30℃；进样量10μL。HPLC图见图1，三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1在上述色谱条件下与其他成分实现了基线分离。
2.2 对照品溶液的制备
分别称取三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品各5 mg、10mg、5mg、10mg，精密称定，置25 mL容量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，制成含三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Rb1、人参皂苷Re分别为0.260mg·mL-1、0.412 mg·mL-1、0.420mg·mL-1、0.204 mg·mL-1的混合对照液。
2.3 三七药材对照液的制备
取三七粉末(过四号筛)0.6 g，精密称定，加入甲醇50mL，称定重量，放置过夜，置80℃水浴上保持微沸2h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。
2.4 供试品溶液及阴性对照液的制备
取本品20片，精密称定，研细，取约1g，精密称定，加入甲醇15mL，称定重量，置水浴上回流1h，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过取续滤液，即得。同法制得三七的阴性对照液。
2.5 方法学考察
①线性关系考察：分别精密吸取上述混合对照溶液2、4、6、12、16、20(μL)，分别注入高效液相色谱仪中，测定其峰面积，并以对进样量(X，μg)为横坐标，峰面积积分值(Y)为纵坐标进行线性回归处理，回归方程分别为：
三七皂苷R1：Y=1.6220×105X+2.7527×103(r=0.9997)；人参皂苷Rg1：Y=1.9604×105X-2.8334×103(r=0.9999)；人参皂苷Re：Y=1.4266×105X+5.3408×103(r=0.9993)；人参皂苷Rb1：Y=1.5235×105X+1.6954×103(r=0.9999)。
结果表明，三七皂苷R1在0.520～5.20μg范围内具有良好的线性关系；人参皂苷Rg1在0.824～8.24μg范围内具有良好的线性关系；人参皂苷Re在0.408～4.08μg范围内具有良好的线性关系；人参皂苷Rb1在0.840～8.40μg范围内具有良好的线性关系。
②精密度试验：精密吸取上述混合对照溶液与供试样品液10μL，分别连续进样6次，在上述色谱条件下测定4种组分的峰面积积分值，结果对照品的三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的RSD分别为2.51%、1.42%、1.97%、1.38%，供试样品液的三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的RSD分别为2.82%、1.03%、1.35%、1.81%。
③重复性试验：取同一样品，按供试品溶液制备方法制备6份供试样品液，进样测定，记录峰面积，测定结果得三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的RSD分别为2.46%、1.53%、1.68%、1.86%。
图1 HPLC图
A对照品 B三七药材 C样品 D阴性样品
1-三七皂苷R1 2-人参皂苷Rg1 3-人参皂苷Re 4-人参皂苷Rb1
④稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24h进样测定，结果三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1的峰面积的RSD分别为1.16%、1.04%、1.34%、1.55%，表明待测成分在24h内稳定。
⑤加样回收率试验：精密称取已知含量的脑得生样品6份，每份分别精密加入三七皂苷R1与人参皂苷Rg1、人参皂苷Re、人参皂苷Rb1对照品适量，按照供试品溶液制备方法进行操作并测定，计算回收率，结果见表1~4。
⑥样品测定：取不同批次脑得生片样品，按2、4项下操作制备供试品溶液各三份，按上述液相色谱条件进样进行分析测定，结果见表5。
3 讨论
本实验在色谱条件选择时，比较了多种流动相的梯度条件，最后确定的流动相梯度条件能使三七药材和制剂处方中三七的四种成分都达到有效分离。在实验过程中，发现较难分离的主要是人参皂苷Rg1与人参皂苷Re，因此在设计梯度条件时应充分考虑对人参皂苷Rg1与人参皂苷Re的分离效果，同时考虑复方中其他成分的干扰。经实验证实，该方法稳定、可靠、分离效果良好，可用于该制剂的质量控制。
从所得的色谱图中发现，保留时间63min处的色谱峰为三七药材中的一个特征峰，并经初步验证该峰为人参皂苷Rd，可为三七中五种皂苷成分的测定及指纹图谱研究提供色谱条件的参考。
参考文献：
[1] 刘刚，鲍建材，郑友兰.三七的化学成分研究进展[J].人参研究，2004，(2)：10~17.
[2] 沈国芳，吴永江，程翼宇.RP-HPLC测定血栓通注射液中4种皂苷的含量[J].中国药学，2003，38(9)：698~699.
[3] 杨雪梅，刘 旭，刘艳山，等.高效液相色谱法测定三七中三七皂苷R1及人参皂苷Rg1，Rb的含量[J].时珍国医国药，2005，16(8)：710.
(责任编辑：陈涌涛)