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【中图分类号】R97 【文献标识码】A 【文章编号】1672-3783（2013）12-0188-01
【摘要】目的 观察姜黄素对宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用。方法 MTT法检测姜黄素和放射线对Hela细胞的抑制作用，绘制细胞抑制率曲线，研究姜黄素与放射联合应用时的作用特点；流式细胞法检测细胞周期和凋亡。结果 姜黄素对Hela细胞增殖具有明显的抑制作用，并呈时间和浓度依赖性；单纯照射对宫颈癌增殖有平台效应， 联用姜黄素则可进一步增强对宫颈癌的杀伤效应；单独照射和姜黄素均能使细胞周期阻滞于放射敏感时相G2/M期，诱导细胞凋亡，联合作用效果更加显著。结论 姜黄素可通过阻滞细胞周期于G2/M期对宫颈癌Hela细胞产生放疗增敏作用。
放射治疗是宫颈癌的重要治疗手段，对宫颈癌的照射不可避免的会对宫颈周围膀胱、直肠等器官造成辐射损伤 [1]。故而，采用同步放化疗综合治疗模式，即通过同步应用小剂量化疗药物在不增加甚至降低射线剂量的基础上达到增强放射线对肿瘤细胞的杀伤作用已被广泛应用于临床多种肿瘤的治疗[2]。
姜黄素具有多种药理活性。有研究表明姜黄素对胰腺癌[3]、肾癌[4]、前列腺癌[5]具有放疗增敏作用，但对宫颈癌放疗作用报道较少，本文通对此进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌Hela细胞株（湖北医药学院临床研究所）；姜黄素（HPLC>98%，成都思科华生物技术有限公司）；Clinac 600C/D加速器（ 美国Varian 公司）；流式细胞仪（美国Beckman Coluter公司）。
1.2 方法
1.2.1细胞培养 宫颈癌Hela细胞培养于含10%新生牛血清的1640中，并置于含5%C02的37℃孵箱中常规培养，每2-3d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2照射方法 在室温下采用6MV-X线照射，照射野10×10cm，剂量率40 cGy/min，源皮距为100cm，分别一次性给予各实验组6、8、10、12、14、16Gy剂量。
1.2.3放射线对Hela细胞增殖的影响 取对数生长期Hela细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，参照文献按辐射剂量分为6、8、10、12、14、16Gy共6组，每组设5个复孔，给予一次性射线照射12、24、48h后，每孔加入20μL MTT（5g/L），继续孵育4h，弃各孔液体，每孔加入150μL二甲基砜，低速震荡10min，酶标仪检测各孔在562nm波长处吸光度值，计算抑制率，求出辐射剂量坪值，即细胞增殖抑制率达最高的射线剂量。细胞抑制率=（1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值） ×100%。
1.2.4MTT法测定姜黄素的辐射敏感性 取对数生长期细胞制成单细胞悬液，分为空白组、单药组、单放组、药放组。空白组只加细胞与培养液；单放组剂量取上述实验的坪值；单药组姜黄素终浓度参照文献确定为50，25，12.5，6.25，3.125μmol/L共5组，药放组辐射剂量和药物浓度分别同单放组剂量和单药组浓度，共5组，每组设5个平行样本，测定各组吸光值后通过公式计算细胞抑制率。
1.2.5细胞周期分析及凋亡检测 细胞分组及处理同1.2.4，取处理完毕的4组细胞各1×106个， PBS洗2次，加入70%冷乙醇4℃固定过夜，清除固定液，加入PBS100μl混匀细胞，再加入10g/LRNAase2μl充分混匀，置37℃水浴锅中加温30min，加入碘化丙啶（PI）染色液（20μg/ml），常温避光30min后，流式细胞仪检测，Multicycle软件分析，拟合计算出细胞各时相百分比和凋亡率。
1.3统计学分析 所得数据以均数±标准差（x±s）的形式表示，SPSS17.0软件模拟生存曲线并进行单因素方差分析（两两比较采用S-N-K法），以P<0.05为差别有统计学意义，以P<0.01为差别有显著性统计学意义。
2 结果
2.1 Hela细胞对射线照射的敏感性 射线照射对宫颈癌细胞增殖可产生明显的抑制作用，在射线剂量12Gy以内时，随着射线剂量的加大和照射后作用时间的延长，对细胞增殖的抑制率也明显增加，呈现出一定的量效和时效关系。在12Gy处出现坪值，故选用12Gy加药物进行后续的增敏实验。
2.2姜黄素对Hela细胞增殖的影响 经不同浓度姜黄素作用24、48、72h后，Hela细胞增殖均受到不同程度的抑制，并呈时间，浓度依赖性。各浓度姜黄素作用48h，细胞增殖抑制率在7%-81%之间，与对照组比较，12.5μmol/L姜黄素即可产生有统计学差异的抑制作用（P<0.05），而25μmol/L及以上浓度的姜黄素抑制作用则更强（P<0.01）。
2.3姜黄素对Hela细胞的放射增敏作用 选取12Gy剂量射线加不同浓度姜黄素作用于Hela细胞结果显示出细胞增殖抑制率可进一步随药物浓度的增加而升高，当浓度大于25μmol/L时曲线趋于平坦。药物加辐射后，其24h细胞增殖抑制率均较单纯辐射或单纯药物组有统计学差异（P<0.05）。
2.4细胞周期分析及凋亡检测 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡结果表明，与空白组比较，单纯放射或药物均能提高G2/M期细胞比例，诱导细胞出现凋亡（P<0.05），而放射与药物联合则作用效果更为显著（P<0.01）。
3讨论
姜黄素具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗血管新生以及抗肿瘤等多种生物学功能。本研究中，笔者观察了姜黄素同步放疗对宫颈癌Hela细胞增殖的影响，结果发现，单纯应用姜黄素，细胞增殖抑制率与药物浓度的增加成正比；单纯应用放射线照射，细胞抑制率也随射线剂量的增加而增加，但当辐射剂量达到12Gy时细胞增殖抑制率达到坪台期，不再随射线剂量的加大而增加。在此基础上，选用12Gy放射线联合不同浓度的姜黄素做进一步的观察，结果显示，在单纯辐射剂量已达到“阈值”的情况下，联用姜黄素可使细胞增殖抑制效果得到进一步的提高，且对细胞增殖的抑制率高于单纯放射组和单纯药物组（P<0.05），说明同步应用姜黄素确实可对宫颈癌细胞放疗产生增效的作用，但这种增效作用只是控制在一定浓度的范围之内。
为初步探明增效机制，笔者进一步检测了姜黄素同步放疗后对宫颈癌细胞凋亡和细胞周期的影响，结果发现，单独药物、单独射线均能对细胞产生诱导凋亡和G2/M期阻滞的作用，而联合应用后作用效果更为显著，这说明姜黄素的放疗增敏作用与其能阻滞细胞周期于对放疗敏感时相G2/M期有关。△湖北省十堰市科技局基金资助项目（ZD2012026） 湖北医药学院第三临床学院资助项目（201201）
参考文献
[1]金健，张国楠，樊英.同步放化疗治疗中晚期宫颈癌50例临床疗效观察[J].实用妇产科杂志，2007，23（5）：287-289.
[2]徐凤华，郭荣荣，孙华燕.吉非替尼治疗晚期非小细胞肺癌的系统评价[J].中国循证医学杂志，2009，9（2）：218-229.
[3]Veeraraghavan J，Natarajan M，Lagisetty P，etl.Impact of curcumin， raspberry extract， and neem leaf extract on rel protein-regulated celldeath/radiosensitizationin pancreatic cancer cells[J].Pancreas.2011，40（7）：1107-1119.
[4]李刚，王子明，种铁.姜黄素对人肾癌ACHN细胞放射的增敏作用及其机制[J].西安交通大学学报（医学版），2011，32（3）：299-302.
[5]LiM，Zhang Z，Hill DL，etl.Curcumin，a dietary component，has anticancer， chemosensitization，and radiosensitization effects by down-regulating the MDM2 oncogene through the PI3K/mTOR/ETS2 pathway[J].Cancer Res.2007，67（5）：1988-1996.
【摘要】目的 观察姜黄素对宫颈癌Hela细胞的放射增敏作用。方法 MTT法检测姜黄素和放射线对Hela细胞的抑制作用，绘制细胞抑制率曲线，研究姜黄素与放射联合应用时的作用特点；流式细胞法检测细胞周期和凋亡。结果 姜黄素对Hela细胞增殖具有明显的抑制作用，并呈时间和浓度依赖性；单纯照射对宫颈癌增殖有平台效应， 联用姜黄素则可进一步增强对宫颈癌的杀伤效应；单独照射和姜黄素均能使细胞周期阻滞于放射敏感时相G2/M期，诱导细胞凋亡，联合作用效果更加显著。结论 姜黄素可通过阻滞细胞周期于G2/M期对宫颈癌Hela细胞产生放疗增敏作用。
放射治疗是宫颈癌的重要治疗手段，对宫颈癌的照射不可避免的会对宫颈周围膀胱、直肠等器官造成辐射损伤 [1]。故而，采用同步放化疗综合治疗模式，即通过同步应用小剂量化疗药物在不增加甚至降低射线剂量的基础上达到增强放射线对肿瘤细胞的杀伤作用已被广泛应用于临床多种肿瘤的治疗[2]。
姜黄素具有多种药理活性。有研究表明姜黄素对胰腺癌[3]、肾癌[4]、前列腺癌[5]具有放疗增敏作用，但对宫颈癌放疗作用报道较少，本文通对此进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
人宫颈癌Hela细胞株（湖北医药学院临床研究所）；姜黄素（HPLC>98%，成都思科华生物技术有限公司）；Clinac 600C/D加速器（ 美国Varian 公司）；流式细胞仪（美国Beckman Coluter公司）。
1.2 方法
1.2.1细胞培养 宫颈癌Hela细胞培养于含10%新生牛血清的1640中，并置于含5%C02的37℃孵箱中常规培养，每2-3d传代1次，取对数生长期细胞用于实验。
1.2.2照射方法 在室温下采用6MV-X线照射，照射野10×10cm，剂量率40 cGy/min，源皮距为100cm，分别一次性给予各实验组6、8、10、12、14、16Gy剂量。
1.2.3放射线对Hela细胞增殖的影响 取对数生长期Hela细胞，经0.25%胰蛋白酶消化后制成单细胞悬液，参照文献按辐射剂量分为6、8、10、12、14、16Gy共6组，每组设5个复孔，给予一次性射线照射12、24、48h后，每孔加入20μL MTT（5g/L），继续孵育4h，弃各孔液体，每孔加入150μL二甲基砜，低速震荡10min，酶标仪检测各孔在562nm波长处吸光度值，计算抑制率，求出辐射剂量坪值，即细胞增殖抑制率达最高的射线剂量。细胞抑制率=（1-实验组平均吸光度值/对照组平均吸光度值） ×100%。
1.2.4MTT法测定姜黄素的辐射敏感性 取对数生长期细胞制成单细胞悬液，分为空白组、单药组、单放组、药放组。空白组只加细胞与培养液；单放组剂量取上述实验的坪值；单药组姜黄素终浓度参照文献确定为50，25，12.5，6.25，3.125μmol/L共5组，药放组辐射剂量和药物浓度分别同单放组剂量和单药组浓度，共5组，每组设5个平行样本，测定各组吸光值后通过公式计算细胞抑制率。
1.2.5细胞周期分析及凋亡检测 细胞分组及处理同1.2.4，取处理完毕的4组细胞各1×106个， PBS洗2次，加入70%冷乙醇4℃固定过夜，清除固定液，加入PBS100μl混匀细胞，再加入10g/LRNAase2μl充分混匀，置37℃水浴锅中加温30min，加入碘化丙啶（PI）染色液（20μg/ml），常温避光30min后，流式细胞仪检测，Multicycle软件分析，拟合计算出细胞各时相百分比和凋亡率。
1.3统计学分析 所得数据以均数±标准差（x±s）的形式表示，SPSS17.0软件模拟生存曲线并进行单因素方差分析（两两比较采用S-N-K法），以P<0.05为差别有统计学意义，以P<0.01为差别有显著性统计学意义。
2 结果
2.1 Hela细胞对射线照射的敏感性 射线照射对宫颈癌细胞增殖可产生明显的抑制作用，在射线剂量12Gy以内时，随着射线剂量的加大和照射后作用时间的延长，对细胞增殖的抑制率也明显增加，呈现出一定的量效和时效关系。在12Gy处出现坪值，故选用12Gy加药物进行后续的增敏实验。
2.2姜黄素对Hela细胞增殖的影响 经不同浓度姜黄素作用24、48、72h后，Hela细胞增殖均受到不同程度的抑制，并呈时间，浓度依赖性。各浓度姜黄素作用48h，细胞增殖抑制率在7%-81%之间，与对照组比较，12.5μmol/L姜黄素即可产生有统计学差异的抑制作用（P<0.05），而25μmol/L及以上浓度的姜黄素抑制作用则更强（P<0.01）。
2.3姜黄素对Hela细胞的放射增敏作用 选取12Gy剂量射线加不同浓度姜黄素作用于Hela细胞结果显示出细胞增殖抑制率可进一步随药物浓度的增加而升高，当浓度大于25μmol/L时曲线趋于平坦。药物加辐射后，其24h细胞增殖抑制率均较单纯辐射或单纯药物组有统计学差异（P<0.05）。
2.4细胞周期分析及凋亡检测 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡结果表明，与空白组比较，单纯放射或药物均能提高G2/M期细胞比例，诱导细胞出现凋亡（P<0.05），而放射与药物联合则作用效果更为显著（P<0.01）。
3讨论
姜黄素具有抗氧化、抗动脉粥样硬化、抗炎、抗血管新生以及抗肿瘤等多种生物学功能。本研究中，笔者观察了姜黄素同步放疗对宫颈癌Hela细胞增殖的影响，结果发现，单纯应用姜黄素，细胞增殖抑制率与药物浓度的增加成正比；单纯应用放射线照射，细胞抑制率也随射线剂量的增加而增加，但当辐射剂量达到12Gy时细胞增殖抑制率达到坪台期，不再随射线剂量的加大而增加。在此基础上，选用12Gy放射线联合不同浓度的姜黄素做进一步的观察，结果显示，在单纯辐射剂量已达到“阈值”的情况下，联用姜黄素可使细胞增殖抑制效果得到进一步的提高，且对细胞增殖的抑制率高于单纯放射组和单纯药物组（P<0.05），说明同步应用姜黄素确实可对宫颈癌细胞放疗产生增效的作用，但这种增效作用只是控制在一定浓度的范围之内。
为初步探明增效机制，笔者进一步检测了姜黄素同步放疗后对宫颈癌细胞凋亡和细胞周期的影响，结果发现，单独药物、单独射线均能对细胞产生诱导凋亡和G2/M期阻滞的作用，而联合应用后作用效果更为显著，这说明姜黄素的放疗增敏作用与其能阻滞细胞周期于对放疗敏感时相G2/M期有关。△湖北省十堰市科技局基金资助项目（ZD2012026） 湖北医药学院第三临床学院资助项目（201201）
参考文献
[1]金健，张国楠，樊英.同步放化疗治疗中晚期宫颈癌50例临床疗效观察[J].实用妇产科杂志，2007，23（5）：287-289.
[2]徐凤华，郭荣荣，孙华燕.吉非替尼治疗晚期非小细胞肺癌的系统评价[J].中国循证医学杂志，2009，9（2）：218-229.
[3]Veeraraghavan J，Natarajan M，Lagisetty P，etl.Impact of curcumin， raspberry extract， and neem leaf extract on rel protein-regulated celldeath/radiosensitizationin pancreatic cancer cells[J].Pancreas.2011，40（7）：1107-1119.
[4]李刚，王子明，种铁.姜黄素对人肾癌ACHN细胞放射的增敏作用及其机制[J].西安交通大学学报（医学版），2011，32（3）：299-302.
[5]LiM，Zhang Z，Hill DL，etl.Curcumin，a dietary component，has anticancer， chemosensitization，and radiosensitization effects by down-regulating the MDM2 oncogene through the PI3K/mTOR/ETS2 pathway[J].Cancer Res.2007，67（5）：1988-1996.