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摘 要 为了分析SlARF2基因在番茄生长发育过程中的功能，利用定量PCR技术分析SlARF2基因的表达模式，发现SlARF2基因在番茄花芽中表达量最高，在幼果中次之，说明SlARF2基因可能在番茄花果发育中起着重要作用。为进一步研究SlARF2的功能，构建SlARF2基因超表达、抑制表达载体，农杆菌介导转化番茄成功获得了相应转基因植株。通过与野生型番茄植株花、果不同时期的表型进行比对分析，发现SlARF2基因的超表达对花的形态学特征无明显影响，但能够显著提高植株的结实率、降低果实大小和重量。说明SlARF2基因参与调控番茄花、果发育过程。
关键词 番茄；SlARF2；表达模式；果实发育
中图分类号 S641.2 文献标识码 A
Abstract To investigate the function of SlARF2 in tomato development， we analyzed the expression pattern of SlARF2 by Real-time PCR. We found that SlARF2 was highly expressed in tomato bud and immature fruit， suggesting that SlARF2 plays an important role in tomato flower and fruit development. Furthermore， we constructed SlARF2 overexpression and suppress expression vectors. By agrobacterium infection， we finally obtained the SlARF2 overexpression and suppress transgenetic tomatoes. Compared the transgenetic tomatoes to wild type tomato， we found that SlARF2 had no affection in the morphology of flower， however SlARF2 overexpression strongly enhanced the rape rate of tomato and decreased the size of tomato fruit. The study demonstrates that SlARF2 regulates the development of tomato flower and fruit， and provides basic reference for further study of SlARF2 function.
Key words Tomato； SlARF2； Expression pattern； Fruit development
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.015
生长素是植物生长激素中最为重要的一种激素，通过调节早期生长素响应基因的表达，调控植物生长发育的多个阶段如：顶端优势、向性生长、侧根的形成、微管的分化、胚胎发育等[1]。在早期生长素响应基因的启动子区域包含一个保守的顺式作用元件TGTCTC，称为生长素响应元件（AuxRE）[2]。能够与该元件结合并调节生长素响应的一种转录因子称为生长素响应因子（auxin response factor ARFs）。ARFs是植物生长素信号途径中一个重要的转录因子，它正向或者反向的调控生长素相关基因的表达，从而调控植物生长发育过程[3]。通过对番茄、拟南芥、土豆、水稻、葡萄ARF家族成员的蛋白质序列比对分析，建立系统进化树，将ARF家族划分为四个分支。其中，ARF I a， II b， III and IV 亚家族基因的蛋白中间区域含有一个抑制功能域，推测这些亚家族的ARF蛋白为转录抑制子[4-5]。ARF2基因属于ARF I a亚家族成员，作为一个潜在的生长素负调控转录因子，已经在多种模式植物中被克隆研究。在拟南芥中，arf2突变体表现出对植物生长发育多向性的调节影响，包括植株变大、组织形态异常等[6]。ARF2基因在植物生长发育的多个阶段都有表达，arf2突变体在植物衰老的多个过程中均表现出明显的延迟现象，包括花的脱落，叶的衰老以及角果的成熟[7]。有研究发现，arf2突变能促使组织细胞分裂增强，arf2突变株系中，茎和莲座中与细胞周期相关的CYCD3；1基因和与细胞分裂相关的ANT基因表达时期都被相应的延长，说明ARF2是一个细胞分裂和组织发育的抑制因子[8]。ARF2还介导生长素与其他植物激素的互作。乙烯可以通过蛋白酶体途径介导ARF2蛋白的降解，并且该过程与乙烯促进生长素的合成途径是相互独立的[9-10]。在生长素和ABA交互通路中ARF2与HB33作为新型的调控因子，对植物生长起着重要的调控作用[11]。油菜素内酯（BR）调控通路中的重要基因BIN2磷酸化会导致ARF2的DNA结合和抑制能力缺失，BIN2通过钝化ARFs增强生长素诱导基因的表达[12]。ARF2对番茄生长与发育具体的调控功能，尤其是对花和果实发育的作用至今仍不清楚。本文以番茄SlARF2基因作为研究目标，分析其在番茄花与果实发育中的功能，以期为明确番茄SlARF2的发育调控功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 番茄（Solanum lycopersicum，cv Micro Tom）、大肠杆菌JM109和农杆菌（Agrobacterium）菌株C58由本实验室保存。1.2.3 植物表达载体的构建 克隆SlARF2基因全长时，在引物F1的 5′端设计加入BamH I酶切位点，在引物F2 的5′端设计加入Xba I酶切位点。克隆得到具有BamH I、Xba I双酶切位点的全长基因。BamH I、Xba I双酶切处理pCAMBIA-35S载体，37 ℃，1 h，胶回收纯化。T4连接酶连接处理过后的SlARF2基因片段和pCAMBIA-35S载体，16 ℃过夜，转入大肠杆菌。菌落PCR筛选鉴定阳性克隆，提质粒，得到pCAMBIA-35S-SlARF2超表达载体。选取全长基因中约600 bp的基因片段，设计引物Fs和Rs，在Fs的5′端设计加入Xba I酶切位点，在Rs的5′端设计加入BamH I酶切位点。克隆得到的基因片段连接至BamH I、Xba I双酶切处理的pCAMBIA-35S载体。筛选阳性克隆，提质粒，得到pCAMBIA-35S-asARF2反义抑制载体。 1.2.4 转基因植株获得及鉴定 叶盘法转化番茄，经卡那霉素抗性筛选，GUS报告基因染色筛选，初步获得阳性转基因植株[14]。转基因植物SlARF2基因表达量鉴定：取各植株同一时期植株叶片提取RNA反转录cDNA，以之为模板进行定量PCR检测（具体步骤见组织表达模式分析），得到各株系SlARF2基因表达量，以野生型中SlARF2表达量为1，确定转基因植株是否超表达或抑制表达。
1.2.5 植物表型鉴定 结实率=所收获的果实数/开花数。番茄果实直径大小用游标卡尺测量。
1.3 数据处理
所得数据用Excel进行方差分析，最小显著差数法（LSD法）进行显著性分析，每个数据样本n≥5，不同的字母代表差异显著，** 代表差异极显著，* 代表差异显著。
2 结果与分析
2.1 ARF2基因的克隆与结构功能域分析
以番茄总RNA反转录成的cDNA为模板，用特异性引物F1和R1进行PCR反应，得到约2 560 bp的片段（图1-A）。将测序结果与数据库中番茄SlARF2基因比对，确认所得片段为ARF2基因。番茄ARF2基因与拟南芥ARF2基因的蛋白质序列比对，相似性为61.7%，2个基因都含有3个明显的保守结构功能区域Domain I、Domain II、Domain III（图1-B），这3个保守结构功能域分别为B3-DNA结合区域、Auxin response factor生长素响应区域以及AUX/IAA家族基因转录激活区域，属于典型的ARF家族保守结构功能域。
2.2 SlARF2植物表达载体的构建
将带有酶切位点的SlARF2全长基因和中间片段，连接至酶切处理的pCAMBIA-35S植物表达载体，转化大肠杆菌，经PCR、酶切验证。确定目的片段已成功的连接到载体。测序结果表明，基因序列及连接方向正确。表明成功构建了SlARF2超表达载体pCAMBIA-35S-SlARF2和反义抑制载体pCAMBIA-35S-asARF2（图2）。通过冻融法将成功构建的表达载体转入农杆菌C58中。
2.3 SlARF2基因在番茄各组织中的表达模式分析
定量PCR分析SlARF2的表达模式。结果发现在番茄根、茎、叶营养生长阶段SlARF2的表达量呈明显的上升趋势，在根中表达最低，茎的表达量约为根中的10倍，叶的表达最高，约为根中的13倍。进入生殖生长阶段后的花芽期达到最高，约为根中表达量的17倍，花和幼果时期的表达量有所下降，为根中表达量的12倍左右，在果实发育阶段SlARF2的表达量明显下降并趋于平稳，为根中表达量的5～7倍（图3）。由此推测SlARF2基因对番茄花以及果实的发育形成具有调控作用。
2.4 SlARF2基因在果实形成发育中的功能分析
为了分析番茄SlARF2基因在番茄果实形成发育过程中的功能，设计构建SlARF2基因的超表达及反义抑制载体，通过遗传转化成功获得了4个超表达转基因株系，ARF2-1、ARF2-3、ARF2-4、ARF2-5和1个反义抑制转基因株系As-ARF2。提取各转基因植株60 d的叶片RNA，反转录得到的cDNA，定量PCR检测各个植株的转基因表达情况。结果表明，转基因株系ARF2-1、ARF2-3中ARF2基因的表达量较高，约为野生型表达量的13倍，ARF2-4植株SlARF2的表达量较低，约为野生型表达量的7倍，ARF2-5植株的SlARF2表达量相对野生型无明显变化，反义抑制植株As-ARF2中SlARF2基因的表达量明显降低，约为野生型中表达量的0.5倍（图4-A）。通过统计植物开花期各转基因植株的开花数量，并与相同生长条件下同时期的野生型植株进行对比，结果表明，开花期各转基因植株的开花数量基本一致（平均每株25朵左右），证明ARF2基因表达量的差异并不能对花的形成产生明显的影响。
在番茄幼果形成期，对各转基因株系的结实率进行统计，结果显示：4个SlARF2超表达转基因株系的结实率明显高于野生型植株，其中ARF2-3株系的结实率最高，ARF2-5次之，ARF2-4和ARF2-1相对于野生型植株也相应增高，As-ARF2反义抑制株系的结实率明显低于野生型植株（图4-B）。证明SlARF2基因的超表达对果实座果有着一定的促进作用。进一步对成熟期果实进行统计分析。结果发现，各转基因株系的果实在数量、大小以及重量上有着明显的差异。ARF2-3的果实大小、重量明显小于其他各株系，ARF2-4、ARF2-1株系的果实大小、重量也明显小于野生型植株果实，ARF2-5株系以及As-ARF2反义抑制株系的果实大小、重量与野生型果实相比无明显变化（图4-C、D；图5）。同时SlARF2基因表达量的变化与转基因植株果实大小、重量的变化成明显的线性关系（图4-E）。以上-数据表明，随着SlARF2基因表达量的提高，转基因株系果实的大小和重量相应减小。
综上所述，在番茄果实发育过程中SlARF2基因显著影响了植株的结实率、果实大小和重量，证明ARF2基因是调控果实发育的一个重要因子。
3 讨论与结论
本研究以番茄SlARF2基因为对象，成功构建了SlARF2基因的超表达和反义抑制载体，并获得了相应的转基因植株作为后续分析材料。通过对SlARF2基因表达模式的分析，发现SlARF2基因的主要表达时期处于番茄的生殖生长阶段，从花芽开始贯穿于花、果发育的整个过程中。通过对所得到的转基因株系材料的花、果分析发现，SlARF2基因在花蕾中表达量最高，在开放花中表达量也较高，但对花的形成并没有产生明显的影响。在其他研究中，拟南芥arf2突变株系中会表现出花形态异常，开花延迟和花序长而密集的表型[5]。因此，为了明确SlARF2基因在番茄花形成阶段的功能，还需要进一步对所得到的转基因植株开花时期的对应生理生化指标进行研究。 本研究通过对转基因植株的SlARF2基因表达量，结实率以及成熟后果实的统计分析，发现各植株的结实率、果实大小和重量与SlARF2基因的表达量呈明显的线性关系（图4-E），SlARF2基因表达量越高则结实率越高，成熟后的果实则越小，这与arf2突变株系在拟南芥中导致花不育的结果吻合[5]。推测SlARF2的表达可能直接影响番茄果实的形成和发育。SlARF2基因对于植物果实结实率以及果实大小的影响可能是因为SlARF2基因的表达直接影响了植物的结实率，而在营养均等的情况下高结实率植株的果实则会表现出相应的营养短缺，从而间接影响果实的大小。由此在后续研究中，需要进一步证明SlARF2基因调控植物结实率以及果实大小之间的联系。SlARF2转基因株系果实表现出较为明显的果实表型：果实大小有着明显的差异，同时各SlARF2超表达株系的果实呈现圆润且饱满，而野生型果实的底部明显尖细且果实呈心型（图5），这与同家族基因SlARF7的研究具有一致性[15]，从形态学分析，可能是由于SlARF2直接影响了番茄的细胞分裂所致。但结合结实率受影响这一结果，推测可能是因为SlARF2基因在果实形成过程中影响了营养的分配所致，对此尚有待深入研究。
参考文献
[1] Kumar R， Tyagi A K， Sharma A K， et al. Genome-wide analysis of auxin response factor（ARF）gene family from tomato and analysis of their role in flower and fruit development[J]. Mol Genet Genomics， 2011， 285（3）： 245-260.
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关键词 番茄；SlARF2；表达模式；果实发育
中图分类号 S641.2 文献标识码 A
Abstract To investigate the function of SlARF2 in tomato development， we analyzed the expression pattern of SlARF2 by Real-time PCR. We found that SlARF2 was highly expressed in tomato bud and immature fruit， suggesting that SlARF2 plays an important role in tomato flower and fruit development. Furthermore， we constructed SlARF2 overexpression and suppress expression vectors. By agrobacterium infection， we finally obtained the SlARF2 overexpression and suppress transgenetic tomatoes. Compared the transgenetic tomatoes to wild type tomato， we found that SlARF2 had no affection in the morphology of flower， however SlARF2 overexpression strongly enhanced the rape rate of tomato and decreased the size of tomato fruit. The study demonstrates that SlARF2 regulates the development of tomato flower and fruit， and provides basic reference for further study of SlARF2 function.
Key words Tomato； SlARF2； Expression pattern； Fruit development
doi 10.3969/j.issn.1000-2561.2014.10.015
生长素是植物生长激素中最为重要的一种激素，通过调节早期生长素响应基因的表达，调控植物生长发育的多个阶段如：顶端优势、向性生长、侧根的形成、微管的分化、胚胎发育等[1]。在早期生长素响应基因的启动子区域包含一个保守的顺式作用元件TGTCTC，称为生长素响应元件（AuxRE）[2]。能够与该元件结合并调节生长素响应的一种转录因子称为生长素响应因子（auxin response factor ARFs）。ARFs是植物生长素信号途径中一个重要的转录因子，它正向或者反向的调控生长素相关基因的表达，从而调控植物生长发育过程[3]。通过对番茄、拟南芥、土豆、水稻、葡萄ARF家族成员的蛋白质序列比对分析，建立系统进化树，将ARF家族划分为四个分支。其中，ARF I a， II b， III and IV 亚家族基因的蛋白中间区域含有一个抑制功能域，推测这些亚家族的ARF蛋白为转录抑制子[4-5]。ARF2基因属于ARF I a亚家族成员，作为一个潜在的生长素负调控转录因子，已经在多种模式植物中被克隆研究。在拟南芥中，arf2突变体表现出对植物生长发育多向性的调节影响，包括植株变大、组织形态异常等[6]。ARF2基因在植物生长发育的多个阶段都有表达，arf2突变体在植物衰老的多个过程中均表现出明显的延迟现象，包括花的脱落，叶的衰老以及角果的成熟[7]。有研究发现，arf2突变能促使组织细胞分裂增强，arf2突变株系中，茎和莲座中与细胞周期相关的CYCD3；1基因和与细胞分裂相关的ANT基因表达时期都被相应的延长，说明ARF2是一个细胞分裂和组织发育的抑制因子[8]。ARF2还介导生长素与其他植物激素的互作。乙烯可以通过蛋白酶体途径介导ARF2蛋白的降解，并且该过程与乙烯促进生长素的合成途径是相互独立的[9-10]。在生长素和ABA交互通路中ARF2与HB33作为新型的调控因子，对植物生长起着重要的调控作用[11]。油菜素内酯（BR）调控通路中的重要基因BIN2磷酸化会导致ARF2的DNA结合和抑制能力缺失，BIN2通过钝化ARFs增强生长素诱导基因的表达[12]。ARF2对番茄生长与发育具体的调控功能，尤其是对花和果实发育的作用至今仍不清楚。本文以番茄SlARF2基因作为研究目标，分析其在番茄花与果实发育中的功能，以期为明确番茄SlARF2的发育调控功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 植物材料 番茄（Solanum lycopersicum，cv Micro Tom）、大肠杆菌JM109和农杆菌（Agrobacterium）菌株C58由本实验室保存。1.2.3 植物表达载体的构建 克隆SlARF2基因全长时，在引物F1的 5′端设计加入BamH I酶切位点，在引物F2 的5′端设计加入Xba I酶切位点。克隆得到具有BamH I、Xba I双酶切位点的全长基因。BamH I、Xba I双酶切处理pCAMBIA-35S载体，37 ℃，1 h，胶回收纯化。T4连接酶连接处理过后的SlARF2基因片段和pCAMBIA-35S载体，16 ℃过夜，转入大肠杆菌。菌落PCR筛选鉴定阳性克隆，提质粒，得到pCAMBIA-35S-SlARF2超表达载体。选取全长基因中约600 bp的基因片段，设计引物Fs和Rs，在Fs的5′端设计加入Xba I酶切位点，在Rs的5′端设计加入BamH I酶切位点。克隆得到的基因片段连接至BamH I、Xba I双酶切处理的pCAMBIA-35S载体。筛选阳性克隆，提质粒，得到pCAMBIA-35S-asARF2反义抑制载体。 1.2.4 转基因植株获得及鉴定 叶盘法转化番茄，经卡那霉素抗性筛选，GUS报告基因染色筛选，初步获得阳性转基因植株[14]。转基因植物SlARF2基因表达量鉴定：取各植株同一时期植株叶片提取RNA反转录cDNA，以之为模板进行定量PCR检测（具体步骤见组织表达模式分析），得到各株系SlARF2基因表达量，以野生型中SlARF2表达量为1，确定转基因植株是否超表达或抑制表达。
1.2.5 植物表型鉴定 结实率=所收获的果实数/开花数。番茄果实直径大小用游标卡尺测量。
1.3 数据处理
所得数据用Excel进行方差分析，最小显著差数法（LSD法）进行显著性分析，每个数据样本n≥5，不同的字母代表差异显著，** 代表差异极显著，* 代表差异显著。
2 结果与分析
2.1 ARF2基因的克隆与结构功能域分析
以番茄总RNA反转录成的cDNA为模板，用特异性引物F1和R1进行PCR反应，得到约2 560 bp的片段（图1-A）。将测序结果与数据库中番茄SlARF2基因比对，确认所得片段为ARF2基因。番茄ARF2基因与拟南芥ARF2基因的蛋白质序列比对，相似性为61.7%，2个基因都含有3个明显的保守结构功能区域Domain I、Domain II、Domain III（图1-B），这3个保守结构功能域分别为B3-DNA结合区域、Auxin response factor生长素响应区域以及AUX/IAA家族基因转录激活区域，属于典型的ARF家族保守结构功能域。
2.2 SlARF2植物表达载体的构建
将带有酶切位点的SlARF2全长基因和中间片段，连接至酶切处理的pCAMBIA-35S植物表达载体，转化大肠杆菌，经PCR、酶切验证。确定目的片段已成功的连接到载体。测序结果表明，基因序列及连接方向正确。表明成功构建了SlARF2超表达载体pCAMBIA-35S-SlARF2和反义抑制载体pCAMBIA-35S-asARF2（图2）。通过冻融法将成功构建的表达载体转入农杆菌C58中。
2.3 SlARF2基因在番茄各组织中的表达模式分析
定量PCR分析SlARF2的表达模式。结果发现在番茄根、茎、叶营养生长阶段SlARF2的表达量呈明显的上升趋势，在根中表达最低，茎的表达量约为根中的10倍，叶的表达最高，约为根中的13倍。进入生殖生长阶段后的花芽期达到最高，约为根中表达量的17倍，花和幼果时期的表达量有所下降，为根中表达量的12倍左右，在果实发育阶段SlARF2的表达量明显下降并趋于平稳，为根中表达量的5～7倍（图3）。由此推测SlARF2基因对番茄花以及果实的发育形成具有调控作用。
2.4 SlARF2基因在果实形成发育中的功能分析
为了分析番茄SlARF2基因在番茄果实形成发育过程中的功能，设计构建SlARF2基因的超表达及反义抑制载体，通过遗传转化成功获得了4个超表达转基因株系，ARF2-1、ARF2-3、ARF2-4、ARF2-5和1个反义抑制转基因株系As-ARF2。提取各转基因植株60 d的叶片RNA，反转录得到的cDNA，定量PCR检测各个植株的转基因表达情况。结果表明，转基因株系ARF2-1、ARF2-3中ARF2基因的表达量较高，约为野生型表达量的13倍，ARF2-4植株SlARF2的表达量较低，约为野生型表达量的7倍，ARF2-5植株的SlARF2表达量相对野生型无明显变化，反义抑制植株As-ARF2中SlARF2基因的表达量明显降低，约为野生型中表达量的0.5倍（图4-A）。通过统计植物开花期各转基因植株的开花数量，并与相同生长条件下同时期的野生型植株进行对比，结果表明，开花期各转基因植株的开花数量基本一致（平均每株25朵左右），证明ARF2基因表达量的差异并不能对花的形成产生明显的影响。
在番茄幼果形成期，对各转基因株系的结实率进行统计，结果显示：4个SlARF2超表达转基因株系的结实率明显高于野生型植株，其中ARF2-3株系的结实率最高，ARF2-5次之，ARF2-4和ARF2-1相对于野生型植株也相应增高，As-ARF2反义抑制株系的结实率明显低于野生型植株（图4-B）。证明SlARF2基因的超表达对果实座果有着一定的促进作用。进一步对成熟期果实进行统计分析。结果发现，各转基因株系的果实在数量、大小以及重量上有着明显的差异。ARF2-3的果实大小、重量明显小于其他各株系，ARF2-4、ARF2-1株系的果实大小、重量也明显小于野生型植株果实，ARF2-5株系以及As-ARF2反义抑制株系的果实大小、重量与野生型果实相比无明显变化（图4-C、D；图5）。同时SlARF2基因表达量的变化与转基因植株果实大小、重量的变化成明显的线性关系（图4-E）。以上-数据表明，随着SlARF2基因表达量的提高，转基因株系果实的大小和重量相应减小。
综上所述，在番茄果实发育过程中SlARF2基因显著影响了植株的结实率、果实大小和重量，证明ARF2基因是调控果实发育的一个重要因子。
3 讨论与结论
本研究以番茄SlARF2基因为对象，成功构建了SlARF2基因的超表达和反义抑制载体，并获得了相应的转基因植株作为后续分析材料。通过对SlARF2基因表达模式的分析，发现SlARF2基因的主要表达时期处于番茄的生殖生长阶段，从花芽开始贯穿于花、果发育的整个过程中。通过对所得到的转基因株系材料的花、果分析发现，SlARF2基因在花蕾中表达量最高，在开放花中表达量也较高，但对花的形成并没有产生明显的影响。在其他研究中，拟南芥arf2突变株系中会表现出花形态异常，开花延迟和花序长而密集的表型[5]。因此，为了明确SlARF2基因在番茄花形成阶段的功能，还需要进一步对所得到的转基因植株开花时期的对应生理生化指标进行研究。 本研究通过对转基因植株的SlARF2基因表达量，结实率以及成熟后果实的统计分析，发现各植株的结实率、果实大小和重量与SlARF2基因的表达量呈明显的线性关系（图4-E），SlARF2基因表达量越高则结实率越高，成熟后的果实则越小，这与arf2突变株系在拟南芥中导致花不育的结果吻合[5]。推测SlARF2的表达可能直接影响番茄果实的形成和发育。SlARF2基因对于植物果实结实率以及果实大小的影响可能是因为SlARF2基因的表达直接影响了植物的结实率，而在营养均等的情况下高结实率植株的果实则会表现出相应的营养短缺，从而间接影响果实的大小。由此在后续研究中，需要进一步证明SlARF2基因调控植物结实率以及果实大小之间的联系。SlARF2转基因株系果实表现出较为明显的果实表型：果实大小有着明显的差异，同时各SlARF2超表达株系的果实呈现圆润且饱满，而野生型果实的底部明显尖细且果实呈心型（图5），这与同家族基因SlARF7的研究具有一致性[15]，从形态学分析，可能是由于SlARF2直接影响了番茄的细胞分裂所致。但结合结实率受影响这一结果，推测可能是因为SlARF2基因在果实形成过程中影响了营养的分配所致，对此尚有待深入研究。
参考文献
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