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【摘要】目的 研究辛伐他汀对脓毒症并发急性呼吸窘迫综合征（ARDS）患者外周血CD4+ CD25+调节性T细胞（Treg）的影响。方法 65例脓毒症患者随机分为辛伐他汀治疗组（n=32）和对照组（n=33）。采集患者入选研究后的外周血行白细胞计数（WBC），C反应蛋白（CRP），降钙素原（PCT）检测来反映患者的感染程度，同时记录急性生理和慢性健康（APACHE Ⅱ）评分，流式细胞术（FCM）检测各组入选时、1、3、5、7、14 d的外周血CD4+ CD25+ Treg的水平。结果 两组间的一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05）。辛伐他汀治疗组的CD4+ CD25+Treg在T淋巴细胞中的百分比逐渐下降，第14天两组间比较差异具有统计学意义[（7.32±1.86）% VS （10.01±5.63）%，t=2.568，P=0.013）]。结论 辛伐他汀能改善脓毒症并发ARDS患者Treg过多的现象，起到调节免疫紊乱的功能。
【关键词】辛伐他汀;脓毒症;急性呼吸窘迫综合征;调节性T细胞;流式细胞术
脓毒症（sepsis）是感染引起的全身炎症反应综合征（SIRS），脓毒症的进一步发展可导致脓毒性休克和多器官功能障碍综合征（MODS），有研究证明免疫紊乱状态时是脓毒症发展为MODS主要的机制之一。CD4+ CD25+ 调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是目前研究最为深入的天然Treg，脓毒症体内过多的Treg，介导了脓毒症的免疫抑制功能，被认为和脓毒症诱导MODS有关。脓毒症诱导的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是脓毒症在肺部的临床表现。研究证明他汀类药物可有效控制脓毒症体内炎症水平，降低病死率，但具体机制尚未阐明，因此本研究探讨辛伐他汀对脓毒症并发ARDS患者CD4+ CD25+ 调节性T细胞的影响，为脓毒症的免疫调节治疗提供新的理论依据。现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 2013年8月～2014年8月本院重症医学科收治的65例脓毒症并发ARDS患者，男41例（63.08%），女24例（36.92%），年龄19～87岁，平均年龄（59.52±19.31）岁;原发病构成：下呼吸道感染19例（29.23%），腹腔感染16例（24.62%），外伤15例（23.08%），泌尿系统感染8例（12.31%），其他7例（10.77%）。脓毒症诊断参考脓毒症运动2012标准，ARDS诊断标准参考柏林会议2012标准。排除标准：①恶性肿瘤。②基础疾病有严重脏器功能不全。③3个月内服用过免疫抑制剂药物和（或）激素。数字随机法将65例患者分为辛伐他汀治疗组（n=32）和对照组（n=33）。
1. 2 研究方法 收集患者入院研究时的一般资料（包括年龄、性别、病因构成、病原菌构成、是否机械通气等），采集外周血行WBC，CRP，PCT监测来反映患者的感染程度，同时记录APACHE Ⅱ评分反映患者的疾病严重程度。对照组按照脓毒症运动2012年指南给予治疗，包括液体复苏，抗生素治疗，器官支持等;治疗组在对照组的基础上胃肠道给予辛伐他汀10 mg，1次/d。收集各组患者入选时、1、3、5、7、14 d的外周血送检。
1. 3 Treg分离及检测 外周血标本1500 r/min离心4 min，弃血清加入PBS混匀至3 ml，加入6 ml 淋巴细胞分离液上层3000 r离心15 min后取中层白色细胞。再次离心后计数，加入PE标记抗大鼠CD25单克隆抗体（5 μl/106）孵育15 min，1800 r/min离心10 min后加入抗PE磁珠（20 μl/107），进行磁珠分选，阳性选择获得CD25+ T细胞。解离试剂（20 μl/ml）解离10 min后再次磁珠分选，阴选细胞后加入终止试剂（30 pl/ml），同时加入FITC标记抗大鼠CD4（10 μl/ml）孵育15 min。再加入CD4磁珠孵育15 min，离心后磁珠分选，阳选即得CD4+ CD25+ Treg。FCM检测双阳性细胞的含量。PE-CD25抗体、FITC-CD4抗体-CD4磁珠、大鼠抗PE试剂盒购自美国BD公司，FACS流式细胞仪：美国Becton-Dickinsion公司。
1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示，采用t检验;计数资料采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 两组患者的一般资料比较 两组患者在入选本研究时的性别、年龄、病因构成比、病原菌构成、机械通气、WBC等比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
2. 2 两组外周血的CD4+ CD25+ Treg比较 在治疗过程中，辛伐他汀治疗组的CD4+ CD25+ Treg在淋巴细胞中的百分比逐渐下降，但在1、3、5、7 d比较差异无统计学意义（P>0.05），第14 天两组间比较差异具有统计学意义[（7.32±1.86）% VS （10.01±5.63）%，t=2.568，P=0.013）]。
3 讨论
脓毒症的发生发展涉及到复杂的机体全身炎症网络效应、免疫功能障碍以及宿主对不同感染病原微生物及其毒素的异常反应等多个方面。脓毒症时机体过度的炎症反应，形成 “瀑布效应”，进一步发展可诱发严重脓毒症、脓毒性休克和MODS，最终导致患者死亡。免疫功能紊乱在脓毒症发生、发展过程中具有重要作用，脓毒症机体失控性全身炎症和免疫机能紊乱密切相关，目前认为炎症与免疫反应障碍在脓毒症中并不仅仅表现为“过度炎症反应”，还同时呈现“免疫功能抑制”，表现为“克隆无反应状态”，最终可能发展为“免疫麻痹”。ARDS是以肺毛细血管通透性升高、严重低氧血症和双肺弥漫性改变为特征的临床急重症，病情凶险，病死率高。ARDS的本质是炎症，是全身炎症反应综合征（SIRS）在肺部的表现，其致病因子激活了炎症体液因子，从而导致了体内过度的炎症反应，进一步发展为MODS。脓毒症体内存在过多的CD4+ CD25+ Treg，通过细胞直接接触机制、诱导凋亡和释放细胞因子作用于效应T细胞三种途径发生免疫抑制作用。CD4+ CD25+ Treg高表达叉头框蛋白3（FOXP3）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GIFR），各自或共同通过不同途径发挥抑制效应T细胞功能。
近年研究发现，他汀类药物除了传统的调脂功能外，还具有抗炎、调节免疫功能、抗氧化、稳定血管内皮细胞等作用。本研究通过随机对照的方法，觀察辛伐他汀治疗脓毒症并发ARDS患者，对外周血CD4+ CD25+ Treg在T淋巴细胞中的百分比，结果表明辛伐他汀能改善脓毒症并发ARDS患者2周后的体内Treg过多的现象，起到调节免疫紊乱的功能，但本研究局限于Treg数量的研究，对于Treg表明标志物（如FOXP3、CTLA-4、GIFR）和分泌功能[白介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）]及对效应T细胞免疫功能（细胞增殖、Th细胞极化、分泌功能）的影响还需进一步研究。
【关键词】辛伐他汀;脓毒症;急性呼吸窘迫综合征;调节性T细胞;流式细胞术
脓毒症（sepsis）是感染引起的全身炎症反应综合征（SIRS），脓毒症的进一步发展可导致脓毒性休克和多器官功能障碍综合征（MODS），有研究证明免疫紊乱状态时是脓毒症发展为MODS主要的机制之一。CD4+ CD25+ 调节性T细胞（regulatory T cell，Treg）是目前研究最为深入的天然Treg，脓毒症体内过多的Treg，介导了脓毒症的免疫抑制功能，被认为和脓毒症诱导MODS有关。脓毒症诱导的急性呼吸窘迫综合征（acute respiratory distress syndrome，ARDS）是脓毒症在肺部的临床表现。研究证明他汀类药物可有效控制脓毒症体内炎症水平，降低病死率，但具体机制尚未阐明，因此本研究探讨辛伐他汀对脓毒症并发ARDS患者CD4+ CD25+ 调节性T细胞的影响，为脓毒症的免疫调节治疗提供新的理论依据。现报告如下。
1 资料与方法
1. 1 一般资料 2013年8月～2014年8月本院重症医学科收治的65例脓毒症并发ARDS患者，男41例（63.08%），女24例（36.92%），年龄19～87岁，平均年龄（59.52±19.31）岁;原发病构成：下呼吸道感染19例（29.23%），腹腔感染16例（24.62%），外伤15例（23.08%），泌尿系统感染8例（12.31%），其他7例（10.77%）。脓毒症诊断参考脓毒症运动2012标准，ARDS诊断标准参考柏林会议2012标准。排除标准：①恶性肿瘤。②基础疾病有严重脏器功能不全。③3个月内服用过免疫抑制剂药物和（或）激素。数字随机法将65例患者分为辛伐他汀治疗组（n=32）和对照组（n=33）。
1. 2 研究方法 收集患者入院研究时的一般资料（包括年龄、性别、病因构成、病原菌构成、是否机械通气等），采集外周血行WBC，CRP，PCT监测来反映患者的感染程度，同时记录APACHE Ⅱ评分反映患者的疾病严重程度。对照组按照脓毒症运动2012年指南给予治疗，包括液体复苏，抗生素治疗，器官支持等;治疗组在对照组的基础上胃肠道给予辛伐他汀10 mg，1次/d。收集各组患者入选时、1、3、5、7、14 d的外周血送检。
1. 3 Treg分离及检测 外周血标本1500 r/min离心4 min，弃血清加入PBS混匀至3 ml，加入6 ml 淋巴细胞分离液上层3000 r离心15 min后取中层白色细胞。再次离心后计数，加入PE标记抗大鼠CD25单克隆抗体（5 μl/106）孵育15 min，1800 r/min离心10 min后加入抗PE磁珠（20 μl/107），进行磁珠分选，阳性选择获得CD25+ T细胞。解离试剂（20 μl/ml）解离10 min后再次磁珠分选，阴选细胞后加入终止试剂（30 pl/ml），同时加入FITC标记抗大鼠CD4（10 μl/ml）孵育15 min。再加入CD4磁珠孵育15 min，离心后磁珠分选，阳选即得CD4+ CD25+ Treg。FCM检测双阳性细胞的含量。PE-CD25抗体、FITC-CD4抗体-CD4磁珠、大鼠抗PE试剂盒购自美国BD公司，FACS流式细胞仪：美国Becton-Dickinsion公司。
1. 4 统计学方法 采用SPSS19.0统计学软件对数据进行统计学分析。计量资料以均数±标准差（ x-±s）表示，采用t检验;计数资料采用χ2检验。P<0.05表示差异具有统计学意义。
2 结果
2. 1 两组患者的一般资料比较 两组患者在入选本研究时的性别、年龄、病因构成比、病原菌构成、机械通气、WBC等比较，差异无统计学意义（P>0.05）。
2. 2 两组外周血的CD4+ CD25+ Treg比较 在治疗过程中，辛伐他汀治疗组的CD4+ CD25+ Treg在淋巴细胞中的百分比逐渐下降，但在1、3、5、7 d比较差异无统计学意义（P>0.05），第14 天两组间比较差异具有统计学意义[（7.32±1.86）% VS （10.01±5.63）%，t=2.568，P=0.013）]。
3 讨论
脓毒症的发生发展涉及到复杂的机体全身炎症网络效应、免疫功能障碍以及宿主对不同感染病原微生物及其毒素的异常反应等多个方面。脓毒症时机体过度的炎症反应，形成 “瀑布效应”，进一步发展可诱发严重脓毒症、脓毒性休克和MODS，最终导致患者死亡。免疫功能紊乱在脓毒症发生、发展过程中具有重要作用，脓毒症机体失控性全身炎症和免疫机能紊乱密切相关，目前认为炎症与免疫反应障碍在脓毒症中并不仅仅表现为“过度炎症反应”，还同时呈现“免疫功能抑制”，表现为“克隆无反应状态”，最终可能发展为“免疫麻痹”。ARDS是以肺毛细血管通透性升高、严重低氧血症和双肺弥漫性改变为特征的临床急重症，病情凶险，病死率高。ARDS的本质是炎症，是全身炎症反应综合征（SIRS）在肺部的表现，其致病因子激活了炎症体液因子，从而导致了体内过度的炎症反应，进一步发展为MODS。脓毒症体内存在过多的CD4+ CD25+ Treg，通过细胞直接接触机制、诱导凋亡和释放细胞因子作用于效应T细胞三种途径发生免疫抑制作用。CD4+ CD25+ Treg高表达叉头框蛋白3（FOXP3）、细胞毒性T淋巴细胞相关抗原-4（CTLA-4）和糖皮质激素诱导的肿瘤坏死因子受体（GIFR），各自或共同通过不同途径发挥抑制效应T细胞功能。
近年研究发现，他汀类药物除了传统的调脂功能外，还具有抗炎、调节免疫功能、抗氧化、稳定血管内皮细胞等作用。本研究通过随机对照的方法，觀察辛伐他汀治疗脓毒症并发ARDS患者，对外周血CD4+ CD25+ Treg在T淋巴细胞中的百分比，结果表明辛伐他汀能改善脓毒症并发ARDS患者2周后的体内Treg过多的现象，起到调节免疫紊乱的功能，但本研究局限于Treg数量的研究，对于Treg表明标志物（如FOXP3、CTLA-4、GIFR）和分泌功能[白介素-10（IL-10）、转化生长因子-β（TGF-β）]及对效应T细胞免疫功能（细胞增殖、Th细胞极化、分泌功能）的影响还需进一步研究。