[目的]探究连翘苷对结肠癌的抑制作用及其可能的机制。[方法]将结肠癌SW480细胞分为对照组，连翘苷低、中、高浓度组和5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil,5-Fu）组。以噻唑蓝（methy thiazolyl tetrazolium,MTT）法检测细胞活性，克隆形成试验检测连翘苷对SW480细胞增殖的作用，微球体形成试验检测干细胞成球直径和成球数量，定量反转录聚合酶链式反应（quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR）检测Nanog、性别决定区Y盒子2（sex-determining region Y box 2,SOX2）、醛脱氢酶1（aldehyde dehydrogenase 1,ALDH1）、八聚体结合转录因子4（octamer binding transcription factor 4,OCT4）、Wnt、β-catenin和糖原合成酶激酶-3β（glycogen synthase kinase-3β,GSK-3β）mRNA的相对表达水平，免疫印迹检测Nanog、SOX2、ALDH1、OCT4、Wnt、β-catenin、磷酸化GSK-3β（phospho-GSK-3β,p-GSK-3β）和GSK-3β蛋白的相对表达水平。建立结肠癌异种移植瘤模型，观察连翘苷对体内结肠癌生长的效应，免疫组化检测移植瘤组织中Ki-67、Nanog和SOX2的阳性表达量，免疫印迹检测结肠癌异种移植瘤组织中Wnt和β-catenin蛋白的表达量。[结果]与对照组比较，连翘苷各浓度组SW480细胞活性和克隆形成数降低（P＜0.05,P＜0.05），干细胞成球直径和成球数量降低（P＜0.05,P＜0.05）,Nanog、SOX2、ALDH1、OCT4、Wnt、β-catenin mRNA和蛋白相对表达水平降低（P＜0.05,P＜0.05）,p-GSK-3β蛋白表达水平降低（P＜0.05），而GSK-3β蛋白相对表达水平升高（P＜0.05）。在体内实验中，与控制组比较，实验组的结肠癌异种移植瘤质量减轻（P＜0.05），异种移植瘤组织中Ki-67、Nanog和SOX2的阳性表达下调（P＜0.05,P＜0.05,P＜0.05）,Wnt和β-catenin蛋白表达下调（P＜0.05,P＜0.05）。[结论]连翘苷能抑制体内外结肠癌细胞增殖及干细胞特性，其机制可能与抑制Wnt/β-catenin通路有关。