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摘要：目的： 探讨免疫性血小板减少症患者外周血T细胞受体β链V区亚家族的表达及临床意义。方法： 选取52例健康人作为健康对照组，52例免疫性血小板减少症患者作为ITP组，分离健康对照组和ITP组常规治疗前后的外周血T细胞，采用流式方法检测TCR Vβ24个亚家族的表达情况，。结果： 和健康对照组24个亚家族几乎全部表达比较，ITP患者治疗前平均表达（10.82±4.56，Range：6-16）个Vβ亚家族，Vβ4、Vβ6-12、Vβ17、Vβ20、Vβ24均表现为低表达或无表达；ITP组治疗后平均表达（18.54±5.02，Range：13-24）个Vβ亚家族，Vβ4、Vβ6-12、Vβ17、Vβ20、Vβ24表达均有所恢复，ITP组治疗前与健康对照组，ITP组治疗前、后分别比较，Vβ亚家族的表达差异均有统计学意义（P<0.05）。 结论： 免疫性血小板减少症的发生发展过程与的TCR Vβ24个亚家族的表达具有相关性，监测外周血中TCR Vβ24个亚家族的表达情况能协助免疫性血小板减少症患者的临床诊治，具有较大的推广价值。
关键词：免疫性血小板减少症 T细胞受体 β链V区亚家族
免疫性血小板减少症（ITP）既往称特发性血小板减少性紫癜，是临床上最常见的一种获得性自身免疫出血性疾病，主要表现为血小板减少，伴或不伴皮肤黏膜出血等[1-2]。据欧美相关报道， 目前ITP 的发病率为5/10万-10/10万[3]。传统观念多认为ITP的病理机制为B细胞介导的自身抗体的产生导致了血小板的破坏，但近年来，越来越多的学者开始关注T细胞的异常表达在ITP发病机制中的重要作用[4]。研究发现，T细胞受体β链V区亚家族（TCR Vβ）的表达受限出现在了ITP等多种自身免疫性疾病中[5]。本文主要探讨免疫性血小板减少症患者外周血TCR Vβ亚家族的表达，为ITP的诊断提供新的实验室依据，为ITP的治疗提供新的方向。现报道如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料
选取我院血液病科2012年3月至2013年3月收治的ITP患者52例作为ITP组，男性18例，女性34例，年龄20-78岁，平均年龄（52.21±10.36）岁；健康对照组52例，男性17例，女性35例，年龄20-76岁，平均年龄（49.68±10.95）岁。两组性别、年龄均无显著性差异（P>0.05），具有可比性。
1.2 诊断及排除标准
1.2.1诊断标准[6-7] ：（1）2次以上检查发现血小板计数减少，血细胞形态无异常，伴或不伴皮下、黏膜出血等表现。（2）脾脏一般不增大。（3）骨髓检查：巨核細胞数成熟障碍，数量增多或正常。（4）排除其他继发性血小板减少症、假性血小板减少以及先天性血小板减少等疾病。
1.2.2排除标准：（1）合并其它血小板异常疾病，如甲状腺疾病、再生障碍性贫血、慢性肝病、血小板消耗性疾病、严重感染等；（2）妊娠或哺乳期患者；（3）恶性肿瘤患者；（4）近3月服用过免疫抑制剂患者。
1.3 方法
1.3.1 治疗方法：ITP患者入院即给予常规治疗，基本治疗方案为强的松1-1.5mg/（kg·d）口服，若外周血血小板计数≤10×109/L，或伴严重出血情况时予血小板输注及丙种球蛋白0.4g/（kg·d）静滴治疗3-5d。
1.3.2 检测方法：（1）外周血采集：ITP组和健康对照组分别采空腹外周静脉血5mL，肝素抗凝，4℃保存备用；（2）T细胞的分离：分离并培养1×106以上的外周血单个T细胞；（3）流式法检测TCR VB亚家族：参考（LOTest）Beta Mark TCR VβRepertoire Kit试剂（德国Backman公司）说明书，每管取100μL单细胞悬液置于流式专用管中，按说明书剂量分别加鼠抗人PC5-CD3、PE-CD4、FITC-CD8荧光标记抗体，再每管依序分别加入A～H抗体，同时加鼠抗人CD3-PC5抗体，FCM分析CD3（+）T细胞的TCR Vβ各亚家族表达情况。
1.3.2 统计学方法 采用统计学SPSS19.0软件对数据进行统计分析，计量资料用t检验，均数表示为（x±s）；计数资料采用χ2检验。完全随机设计多组比较，用ANOVA方法分析。
2 结果
52例ITP患者常规治疗后，均显效或良效。24个TCRVβ亚家族表达情况比较如下：
表2：两组ITP患者低表达TCRVβ亚家族统计
注：经ANOVA分析， ITP 组治疗前低表达TCRVβ亚家族与健康对照组以及治疗后比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.1 与健康对照组24个亚家族几乎全部表达比较，ITP组治疗前平均表达（10.82±4.56，Range：6-16）个TCRVβ亚家族，治疗后平均表达（18.54±5.02，Range：13-24）个Vβ亚家族，健康对照组与ITP组、ITP组治疗前后均数比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.2 由图表1和表2可知， ITP组24个TCRVβ亚家族中，治疗前Vβ4、Vβ6-12、Vβ17、Vβ20、Vβ24均表现为低表达或无表达，治疗后Vβ4、Vβ6-12、Vβ17、Vβ20、Vβ24表达均有所恢复，健康对照组与ITP组、ITP组治疗前后Vβ4、Vβ6-12、Vβ17、Vβ20、Vβ24间差异均有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
目前认为免疫性血小板减少症是一种免疫介导的血小板减少综合征，其发病机制的研究主要集中于细胞免疫及体液免疫异常、巨核细胞成熟障碍以及血小板破坏加速等方面[8]，而TCR Vβ亚家族的限制性表达是近几年来学者们广泛关注的领域。ITP的诊断方式仍是临床排除性诊断，特殊实验室检查包括血小板抗体的检测和血小板生成素的检测，但一般不作为常规检测方法，故临床中尚缺乏简便有效的确诊手段。 健康人的TCR Vβ区基因重排是随机的，所以24个亚家族几乎全部表达并执行各自的职能，故T细胞呈现多家族、多克隆性的特点[9]。当机体在疾病状况下，T细胞增殖发生异常以及受到特定抗原刺激或免疫因子抑制作用等，24个亚家族的基因表达可能会出现相应改变，这些改变可以反映机体T細胞免疫功能状态。目前，ITP相关TCR Vβ基因临床研究报道尚少，但大量研究显示，TCR Vβ基因谱系和T细胞克隆性分析已被国内外学者广泛应用于多种自身免疫性疾病的临床研究中[10，11]。
本研究报道了健康人和ITP患者常规治疗前后外周血TCR Vβ亚家族的表达情况，虽然机制尚未清楚，但ITP患者TCR Vβ部分亚家族的限制性表达，以及比较治疗前后TCR Vβ亚家族Vβ4、Vβ6-12、Vβ17、Vβ20、Vβ24表达的差异性可知，免疫性血小板减少症的发生发展过程与的TCR Vβ24个亚家族的表达具有相关性，监测外周血中TCR Vβ24个亚家族的表达情况能协助免疫性血小板减少症患者的临床诊治，具有较大的推广价值。
参考文献：
[1]秦平，侯明.2012版成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识解读[J].临床血液学杂志，2013，26（3）：151-155.
[2]侯明.原发免疫性血小板减少症的现状与展望[J].中华血液学杂志，2012，33（9）：697-698.
[3]Provan D， Stasi R， Newland AC， et al. International consensus report on the investigation and management of primary immune thrombocytopenia [J]. Blood， 2010， 115（2）： 168-186.
[4]李艳秋，牛挺. 原发免疫性血小板减少症研究进展[J].华西医学，2012，27（10）：1570-1573.
[5]张小冬，冯莹.免疫性血小板减少症发病机制的研究进展[J].血栓与止血学2012，18（2）：90-92.
[6]中华医学会血液学分会血栓与止血学组成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识（修订版） [J].中华血液学杂志，2012，32（3）：214-216.
[7]张之南.血液病诊断及疗效标准[M].北京：科学出版社，2007：172—176.
[8]孙雄飞，陈卫布，林海清，等.成人特发性血小板减少性紫癜淋巴细胞亚群研究[J].血栓与止血学，2012，18（4）：155-157.
[9]郭宁宁，黄树林，邵红伟，等.肺癌患者TCR Vt3亚家族表达及记忆性T细胞表达的研究[J].广东药学院学报，2011，27（2）：191-194.
[10] Podojil JR，Miner SD.Molecular mechanisms of T·cell receptor and costimulatory molecule ligation/blockade in autoimmune disease therapy[J].Immunol Rev，2009，229（1）：337-355.
[11] Lee J，Suh WI，Shin EC.T-cell dysfunction and inhibitory receptors in hepatitis C virus infection[J].Immune Network，2010，10（4）：120-125.
关键词：免疫性血小板减少症 T细胞受体 β链V区亚家族
免疫性血小板减少症（ITP）既往称特发性血小板减少性紫癜，是临床上最常见的一种获得性自身免疫出血性疾病，主要表现为血小板减少，伴或不伴皮肤黏膜出血等[1-2]。据欧美相关报道， 目前ITP 的发病率为5/10万-10/10万[3]。传统观念多认为ITP的病理机制为B细胞介导的自身抗体的产生导致了血小板的破坏，但近年来，越来越多的学者开始关注T细胞的异常表达在ITP发病机制中的重要作用[4]。研究发现，T细胞受体β链V区亚家族（TCR Vβ）的表达受限出现在了ITP等多种自身免疫性疾病中[5]。本文主要探讨免疫性血小板减少症患者外周血TCR Vβ亚家族的表达，为ITP的诊断提供新的实验室依据，为ITP的治疗提供新的方向。现报道如下。
1 资料和方法
1.1 一般资料
选取我院血液病科2012年3月至2013年3月收治的ITP患者52例作为ITP组，男性18例，女性34例，年龄20-78岁，平均年龄（52.21±10.36）岁；健康对照组52例，男性17例，女性35例，年龄20-76岁，平均年龄（49.68±10.95）岁。两组性别、年龄均无显著性差异（P>0.05），具有可比性。
1.2 诊断及排除标准
1.2.1诊断标准[6-7] ：（1）2次以上检查发现血小板计数减少，血细胞形态无异常，伴或不伴皮下、黏膜出血等表现。（2）脾脏一般不增大。（3）骨髓检查：巨核細胞数成熟障碍，数量增多或正常。（4）排除其他继发性血小板减少症、假性血小板减少以及先天性血小板减少等疾病。
1.2.2排除标准：（1）合并其它血小板异常疾病，如甲状腺疾病、再生障碍性贫血、慢性肝病、血小板消耗性疾病、严重感染等；（2）妊娠或哺乳期患者；（3）恶性肿瘤患者；（4）近3月服用过免疫抑制剂患者。
1.3 方法
1.3.1 治疗方法：ITP患者入院即给予常规治疗，基本治疗方案为强的松1-1.5mg/（kg·d）口服，若外周血血小板计数≤10×109/L，或伴严重出血情况时予血小板输注及丙种球蛋白0.4g/（kg·d）静滴治疗3-5d。
1.3.2 检测方法：（1）外周血采集：ITP组和健康对照组分别采空腹外周静脉血5mL，肝素抗凝，4℃保存备用；（2）T细胞的分离：分离并培养1×106以上的外周血单个T细胞；（3）流式法检测TCR VB亚家族：参考（LOTest）Beta Mark TCR VβRepertoire Kit试剂（德国Backman公司）说明书，每管取100μL单细胞悬液置于流式专用管中，按说明书剂量分别加鼠抗人PC5-CD3、PE-CD4、FITC-CD8荧光标记抗体，再每管依序分别加入A～H抗体，同时加鼠抗人CD3-PC5抗体，FCM分析CD3（+）T细胞的TCR Vβ各亚家族表达情况。
1.3.2 统计学方法 采用统计学SPSS19.0软件对数据进行统计分析，计量资料用t检验，均数表示为（x±s）；计数资料采用χ2检验。完全随机设计多组比较，用ANOVA方法分析。
2 结果
52例ITP患者常规治疗后，均显效或良效。24个TCRVβ亚家族表达情况比较如下：
表2：两组ITP患者低表达TCRVβ亚家族统计
注：经ANOVA分析， ITP 组治疗前低表达TCRVβ亚家族与健康对照组以及治疗后比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.1 与健康对照组24个亚家族几乎全部表达比较，ITP组治疗前平均表达（10.82±4.56，Range：6-16）个TCRVβ亚家族，治疗后平均表达（18.54±5.02，Range：13-24）个Vβ亚家族，健康对照组与ITP组、ITP组治疗前后均数比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。
2.2 由图表1和表2可知， ITP组24个TCRVβ亚家族中，治疗前Vβ4、Vβ6-12、Vβ17、Vβ20、Vβ24均表现为低表达或无表达，治疗后Vβ4、Vβ6-12、Vβ17、Vβ20、Vβ24表达均有所恢复，健康对照组与ITP组、ITP组治疗前后Vβ4、Vβ6-12、Vβ17、Vβ20、Vβ24间差异均有统计学意义（P<0.05）。
3 讨论
目前认为免疫性血小板减少症是一种免疫介导的血小板减少综合征，其发病机制的研究主要集中于细胞免疫及体液免疫异常、巨核细胞成熟障碍以及血小板破坏加速等方面[8]，而TCR Vβ亚家族的限制性表达是近几年来学者们广泛关注的领域。ITP的诊断方式仍是临床排除性诊断，特殊实验室检查包括血小板抗体的检测和血小板生成素的检测，但一般不作为常规检测方法，故临床中尚缺乏简便有效的确诊手段。 健康人的TCR Vβ区基因重排是随机的，所以24个亚家族几乎全部表达并执行各自的职能，故T细胞呈现多家族、多克隆性的特点[9]。当机体在疾病状况下，T细胞增殖发生异常以及受到特定抗原刺激或免疫因子抑制作用等，24个亚家族的基因表达可能会出现相应改变，这些改变可以反映机体T細胞免疫功能状态。目前，ITP相关TCR Vβ基因临床研究报道尚少，但大量研究显示，TCR Vβ基因谱系和T细胞克隆性分析已被国内外学者广泛应用于多种自身免疫性疾病的临床研究中[10，11]。
本研究报道了健康人和ITP患者常规治疗前后外周血TCR Vβ亚家族的表达情况，虽然机制尚未清楚，但ITP患者TCR Vβ部分亚家族的限制性表达，以及比较治疗前后TCR Vβ亚家族Vβ4、Vβ6-12、Vβ17、Vβ20、Vβ24表达的差异性可知，免疫性血小板减少症的发生发展过程与的TCR Vβ24个亚家族的表达具有相关性，监测外周血中TCR Vβ24个亚家族的表达情况能协助免疫性血小板减少症患者的临床诊治，具有较大的推广价值。
参考文献：
[1]秦平，侯明.2012版成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识解读[J].临床血液学杂志，2013，26（3）：151-155.
[2]侯明.原发免疫性血小板减少症的现状与展望[J].中华血液学杂志，2012，33（9）：697-698.
[3]Provan D， Stasi R， Newland AC， et al. International consensus report on the investigation and management of primary immune thrombocytopenia [J]. Blood， 2010， 115（2）： 168-186.
[4]李艳秋，牛挺. 原发免疫性血小板减少症研究进展[J].华西医学，2012，27（10）：1570-1573.
[5]张小冬，冯莹.免疫性血小板减少症发病机制的研究进展[J].血栓与止血学2012，18（2）：90-92.
[6]中华医学会血液学分会血栓与止血学组成人原发免疫性血小板减少症诊治的中国专家共识（修订版） [J].中华血液学杂志，2012，32（3）：214-216.
[7]张之南.血液病诊断及疗效标准[M].北京：科学出版社，2007：172—176.
[8]孙雄飞，陈卫布，林海清，等.成人特发性血小板减少性紫癜淋巴细胞亚群研究[J].血栓与止血学，2012，18（4）：155-157.
[9]郭宁宁，黄树林，邵红伟，等.肺癌患者TCR Vt3亚家族表达及记忆性T细胞表达的研究[J].广东药学院学报，2011，27（2）：191-194.
[10] Podojil JR，Miner SD.Molecular mechanisms of T·cell receptor and costimulatory molecule ligation/blockade in autoimmune disease therapy[J].Immunol Rev，2009，229（1）：337-355.
[11] Lee J，Suh WI，Shin EC.T-cell dysfunction and inhibitory receptors in hepatitis C virus infection[J].Immune Network，2010，10（4）：120-125.