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摘要：目的 建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器法测定复方苦参注射液中松醇含量的方法。方法 色谱柱为Cosmosil Sugar-D柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流动相为乙腈-水，梯度洗脱，漂移管温度77 ℃，载气流速2.0 L/min。结果 松醇质量在0.5～10.0 ?g范围内与峰面积呈良好的线性关系，r=0.999 6（n=5）；平均回收率为97.30%（RSD=1.29%，n=5）。结论 本方法简便、快速，结果准确、可靠、重复性好。
关键词：复方苦参注射液；高效液相色谱-蒸发光散射检测器法；松醇
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0083-03
复方苦参注射液由苦参和白土茯苓经现代工艺技术精制而成，收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂》第14册[1]，具有清热利湿、凉血解毒、散结止痛功效，临床主要用于癌肿疼痛、出血等症[2-3]。多项研究表明复方苦参注射液具有调节机体免疫功能、协同抗癌、抗炎等药效作用[4-7]。该注射液主要含有苦参生物碱、黄酮及大泽明素等，目前已建立了用酸性染料法测定总生物碱和高效液相色谱法测定苦参碱和氧化苦参碱、大泽明素及三叶豆紫檀苷含量的方法[8-9]。为阐明复方苦参注射液的有效物质基础，达到国家对中药注射液的全面质量要求，本试验建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器法（HPLC- ELSD）测定复方苦参注射液中松醇含量的方法。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（Aglient Technologies 1200 series）；检测器：Alltech ELSD 2000 ES；空气源：GCK 3302全自动空气源（北京中惠普分析技术研究所）。
对照品松醇（自制，纯度>98%），样品为复方苦参注射液（5 mL×5支/盒，山西振东制药股份有限公司，批号分别为20101009、20101121、20101122、20101123、20110109、20110218、20110317、20110406），乙腈为色谱纯（J&K SCIENTIFIC LTD），水为娃哈哈牌纯净水自制成高纯水，其他试剂均为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Cosmosil Sugar-D（250 mm×4.6 mm， 5 ?m）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱：0～20 min， 15%～5%A；20～25 min，5%～15%A；25～45 min，15%A。柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；ELSD温度：77 ℃；全自动空气源气流速：2.0 L/min；进样体积：10 ?L。
2.2 对照品溶液制备
取松醇对照品适量，精密称定，加乙腈-水（20∶80）制成每1 mL含1.0 mg的对照品储备液。精密吸取储备液2 mL于10 mL容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，制成每1 mL含0.2 mg的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密量取复方苦参注射液1 mL于25 mL容量瓶中，用乙腈-水（20∶80）稀释至刻度，即得。
2.4 阴性对照溶液制备
按复方苦参注射液处方比例制备不含苦参药材的样品，按“2.3”项下方法制成阴性对照溶液。
2.5 阴性干扰试验
分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 ?L，按上述色谱条件进行测定，结果阴性对照无干扰。色谱图见图1。
2.6 线性关系考察
精密吸取“2.2”项下对照品储备液0. 5、1、2、5、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成系列对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积的自然对数对质量进行线性回归，得回归方程Y=1.697 1X-1.013 5（r=0.999 6），结果表明松醇在0.5～10.0 ?g范围内线性关系良好。
2.7 精密度试验
取对照品溶液10 ?L，按色谱条件进样测定，重复6次，测得松醇峰面积的RSD=2.88%。
2.8 重复性试验
按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，分别进样10 ?L，测得松醇量的RSD=2.07%。
2.9 稳定性试验
按“2.3”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h测定，进样量10 ?L，测得松醇峰面积的RSD=2.48%，表明样品溶液在12 h内稳定。
2.10 加样回收率试验
精密吸取复方苦参注射液0.5 mL 5份，分别置于25 mL容量瓶中，精密加入松醇对照品约1.5 mg，按“2.3”项下方法配制成供试品溶液5份，按上述色谱条件进样测定峰面积，计算回收率。结果见表1。
2.11 样品含量测定
分别取8个批号的复方苦参注射液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，采用外标二点法求出注射液中松醇含量，并测定相应批号注射液的总固量，计算松醇占总固量的百分含量（松醇量/总固量×100%）。结果见表2。
3 讨论
松醇为从君药苦参中得到的亲水性成分环己烷的六元醇类的甲醚衍生物，存在于松属、豆类及一些植物的花和叶中，是草药夜关门Lespedeza cuneata G.Don和L.sericea Miq.的镇咳和杀菌有效成分[10-11]；该化合物还具有类似胰岛素的作用，有刺激胰岛素分泌的能力，能降低血糖[12]，并对哮喘有一定的治疗作用[10]。松醇为笔者首次从苦参中得到，其在复方苦参注射液中有一定的含量和活性，目前尚未见有关复方苦参注射液中松醇含量检测方法的报道。检测松醇可采用高效液相色谱-二极管阵列检测器法， 在紫外末端吸收（220 nm）检测，测定干扰较大，易影响结果的灵敏度和准确性。本试验所用蒸发光散射检测器为通用质量型检测器，适用于似松醇类型的无C=C双键和共轭结构、无强的生色团的化合物。 由于松醇极性较强，结构与葡萄糖类似，因此采用sugar-D柱测定，通过优化确定流动相为乙腈-水，梯度洗脱，使松醇的色谱峰与相邻峰达到基线分离。
本试验优化了检测器的参数，依据流动相的种类和比例，分别在60～100 ℃的漂移管温度下观察松醇对照品的信号强度，最后确定77 ℃为最佳温度。
参考文献：
[1] 中华人民共和国卫生部.卫生部药品标准·中药成方制剂：第14册[S].1997.
[2] 李春梅.复方苦参注射液的临床应用[J].疾病监测与控制杂志， 2010，4（6）：330-332.
[3] 任贻军，张宏琳.复方苦参注射液的临床应用进展[J].现代医药卫生， 2008，24（5）：715-717.
[4] 贾英杰，张莹，施褔敏.复方苦参注射液对小鼠移植性S180肉瘤血管形成抑制作用[J].天津中医学院学报，2006，25（1）：25-26.
[5] 徐迎春.复方苦参注射液治疗肿瘤的临床研究慨况[J].现代中西医结合杂志，2005，14（17）：2352-2353.
[6] 海丽娜，张志伟，王金华，等.复方苦参注射液对小鼠的镇痛止血和抗应激作用[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（2）：199-202.
[7] 钱锋，周立新，饶云.复方苦参注射液对胃癌术后辅助化疗患者免疫功能的影响[J].肿瘤研究与临床，2006，18（5）：335-336.
[8] 李进冉，张思巨，李琳，等.白土苓药材中大泽明素和总黄酮的含量测定研究[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（8）：68-71.
[9] 白水朋，邓双炳，张思巨，等.苦参和复方苦参注射液中三叶豆紫檀苷的定性定量分析[J].中国医药科学，2012，2（13）：11-13.
[10] 林启寿.中草药化学[M].北京：科学出版社，1997.
[11] 王丹丹，陈佳，陈义娟，等.D-松醇原药及其水剂对黄瓜白粉病的作用方式[J].农药，2012，51（4）：292-295.
[12] Bates SH， Jones RB， Bailey CJ. Insulin-like effect of pinitol[J]. Br J Pharmacol，2000，130（8）：1944-1948.
（收稿日期：2013-07-11，编辑：陈静）
关键词：复方苦参注射液；高效液相色谱-蒸发光散射检测器法；松醇
中图分类号：R284.1 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0083-03
复方苦参注射液由苦参和白土茯苓经现代工艺技术精制而成，收载于《卫生部药品标准·中药成方制剂》第14册[1]，具有清热利湿、凉血解毒、散结止痛功效，临床主要用于癌肿疼痛、出血等症[2-3]。多项研究表明复方苦参注射液具有调节机体免疫功能、协同抗癌、抗炎等药效作用[4-7]。该注射液主要含有苦参生物碱、黄酮及大泽明素等，目前已建立了用酸性染料法测定总生物碱和高效液相色谱法测定苦参碱和氧化苦参碱、大泽明素及三叶豆紫檀苷含量的方法[8-9]。为阐明复方苦参注射液的有效物质基础，达到国家对中药注射液的全面质量要求，本试验建立高效液相色谱-蒸发光散射检测器法（HPLC- ELSD）测定复方苦参注射液中松醇含量的方法。
1 仪器与试药
高效液相色谱仪（Aglient Technologies 1200 series）；检测器：Alltech ELSD 2000 ES；空气源：GCK 3302全自动空气源（北京中惠普分析技术研究所）。
对照品松醇（自制，纯度>98%），样品为复方苦参注射液（5 mL×5支/盒，山西振东制药股份有限公司，批号分别为20101009、20101121、20101122、20101123、20110109、20110218、20110317、20110406），乙腈为色谱纯（J&K SCIENTIFIC LTD），水为娃哈哈牌纯净水自制成高纯水，其他试剂均为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 色谱条件
色谱柱：Cosmosil Sugar-D（250 mm×4.6 mm， 5 ?m）；流动相：乙腈（A）-水（B），梯度洗脱：0～20 min， 15%～5%A；20～25 min，5%～15%A；25～45 min，15%A。柱温：30 ℃；流速：1.0 mL/min；ELSD温度：77 ℃；全自动空气源气流速：2.0 L/min；进样体积：10 ?L。
2.2 对照品溶液制备
取松醇对照品适量，精密称定，加乙腈-水（20∶80）制成每1 mL含1.0 mg的对照品储备液。精密吸取储备液2 mL于10 mL容量瓶中，用溶剂稀释至刻度，制成每1 mL含0.2 mg的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备
精密量取复方苦参注射液1 mL于25 mL容量瓶中，用乙腈-水（20∶80）稀释至刻度，即得。
2.4 阴性对照溶液制备
按复方苦参注射液处方比例制备不含苦参药材的样品，按“2.3”项下方法制成阴性对照溶液。
2.5 阴性干扰试验
分别吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照溶液各10 ?L，按上述色谱条件进行测定，结果阴性对照无干扰。色谱图见图1。
2.6 线性关系考察
精密吸取“2.2”项下对照品储备液0. 5、1、2、5、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，配制成系列对照品溶液。分别吸取上述对照品溶液各10 ?L，注入液相色谱仪，记录色谱图。以峰面积的自然对数对质量进行线性回归，得回归方程Y=1.697 1X-1.013 5（r=0.999 6），结果表明松醇在0.5～10.0 ?g范围内线性关系良好。
2.7 精密度试验
取对照品溶液10 ?L，按色谱条件进样测定，重复6次，测得松醇峰面积的RSD=2.88%。
2.8 重复性试验
按“2.3”项下方法平行制备供试品溶液6份，分别进样10 ?L，测得松醇量的RSD=2.07%。
2.9 稳定性试验
按“2.3”项下方法制备供试品溶液，于0、2、4、6、8、10、12 h测定，进样量10 ?L，测得松醇峰面积的RSD=2.48%，表明样品溶液在12 h内稳定。
2.10 加样回收率试验
精密吸取复方苦参注射液0.5 mL 5份，分别置于25 mL容量瓶中，精密加入松醇对照品约1.5 mg，按“2.3”项下方法配制成供试品溶液5份，按上述色谱条件进样测定峰面积，计算回收率。结果见表1。
2.11 样品含量测定
分别取8个批号的复方苦参注射液，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件进样测定，采用外标二点法求出注射液中松醇含量，并测定相应批号注射液的总固量，计算松醇占总固量的百分含量（松醇量/总固量×100%）。结果见表2。
3 讨论
松醇为从君药苦参中得到的亲水性成分环己烷的六元醇类的甲醚衍生物，存在于松属、豆类及一些植物的花和叶中，是草药夜关门Lespedeza cuneata G.Don和L.sericea Miq.的镇咳和杀菌有效成分[10-11]；该化合物还具有类似胰岛素的作用，有刺激胰岛素分泌的能力，能降低血糖[12]，并对哮喘有一定的治疗作用[10]。松醇为笔者首次从苦参中得到，其在复方苦参注射液中有一定的含量和活性，目前尚未见有关复方苦参注射液中松醇含量检测方法的报道。检测松醇可采用高效液相色谱-二极管阵列检测器法， 在紫外末端吸收（220 nm）检测，测定干扰较大，易影响结果的灵敏度和准确性。本试验所用蒸发光散射检测器为通用质量型检测器，适用于似松醇类型的无C=C双键和共轭结构、无强的生色团的化合物。 由于松醇极性较强，结构与葡萄糖类似，因此采用sugar-D柱测定，通过优化确定流动相为乙腈-水，梯度洗脱，使松醇的色谱峰与相邻峰达到基线分离。
本试验优化了检测器的参数，依据流动相的种类和比例，分别在60～100 ℃的漂移管温度下观察松醇对照品的信号强度，最后确定77 ℃为最佳温度。
参考文献：
[1] 中华人民共和国卫生部.卫生部药品标准·中药成方制剂：第14册[S].1997.
[2] 李春梅.复方苦参注射液的临床应用[J].疾病监测与控制杂志， 2010，4（6）：330-332.
[3] 任贻军，张宏琳.复方苦参注射液的临床应用进展[J].现代医药卫生， 2008，24（5）：715-717.
[4] 贾英杰，张莹，施褔敏.复方苦参注射液对小鼠移植性S180肉瘤血管形成抑制作用[J].天津中医学院学报，2006，25（1）：25-26.
[5] 徐迎春.复方苦参注射液治疗肿瘤的临床研究慨况[J].现代中西医结合杂志，2005，14（17）：2352-2353.
[6] 海丽娜，张志伟，王金华，等.复方苦参注射液对小鼠的镇痛止血和抗应激作用[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（2）：199-202.
[7] 钱锋，周立新，饶云.复方苦参注射液对胃癌术后辅助化疗患者免疫功能的影响[J].肿瘤研究与临床，2006，18（5）：335-336.
[8] 李进冉，张思巨，李琳，等.白土苓药材中大泽明素和总黄酮的含量测定研究[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（8）：68-71.
[9] 白水朋，邓双炳，张思巨，等.苦参和复方苦参注射液中三叶豆紫檀苷的定性定量分析[J].中国医药科学，2012，2（13）：11-13.
[10] 林启寿.中草药化学[M].北京：科学出版社，1997.
[11] 王丹丹，陈佳，陈义娟，等.D-松醇原药及其水剂对黄瓜白粉病的作用方式[J].农药，2012，51（4）：292-295.
[12] Bates SH， Jones RB， Bailey CJ. Insulin-like effect of pinitol[J]. Br J Pharmacol，2000，130（8）：1944-1948.
（收稿日期：2013-07-11，编辑：陈静）