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【摘要】 目的：探讨肺炎支原体（MP）咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）两种检测方法的不同。方法：将198例疑似MP感染的患儿根据年龄分为两组： A组（0～3岁，n=75）、B组（3～12岁，n=123），分别取咽拭子用PCR法测MP-DNA，取血清用IIFA法测MP-IgM，比较两种方法的阳性率。结果：MP-DNA检测阳性率为57.07%，MP-IgM检测阳性率为47.47%，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。A组MP-DNA阳性率48.00%明显高于同组MP-IgM阳性率25.33%，差异有统计学意义（P<0.01）；B组MP-DNA和MP-IgM阳性率分别为62.60%、60.98%比较差异无统计学意义（P>0.05）。结论：PCR与IIFA联合检测可以提高MP感染诊断的准确性。
【关键词】 肺炎支原体； 聚合酶链反应； 间接免疫荧光法； 肺炎支原体抗体
肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是小儿呼吸道感染的常见病原体之一，主要通过呼吸道传染，临床表现多种多样，以呼吸道感染最为多见，并可引起全身各脏器损害[1]。MP的实验室检测方法有很多，近年来发展的咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）法均具有快速、敏感性高的优点[2]。为了客观评价这两种方法的异同，本研究对198例疑似肺炎支原体肺炎患儿分别采集咽拭子和血清同时用咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）检测MP，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取本院儿科收治的疑似MP感染的急性呼吸道感染患儿198例，年龄0～12岁，根据年龄将其分为两组：A组（0～3岁，n=75）、B组（3～12岁，n=123）。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 仪器与试剂 杭州博日line gene PCR扩增仪，ZEISS型荧光显微镜。PCR法试剂盒由凯杰生物工程有限公司生产提供；IIFA法检测试剂盒由西班牙VIRCELL公司生产提供。
1.3 方法 用灭菌棉签采集受试者咽部样本用PCR法检测MP-DNA，同时采集患儿静脉全血，常规分离血清后用IIFA 法检测MP-IgM。操作方法均严格按照说明书进行。
1.4 小儿肺炎支原体肺炎临床诊断标准 持续剧烈咳嗽；全身症状比胸部体征明显；X射线所见较体征显著，胸片可见两肺均匀一致的片状阴影成似大叶性肺炎改变，肺门阴影增浓；白细胞计数正常或稍高，血沉多增快；应用大环内酯类效果好，其他抗生素如青霉素、头孢无效[3-4]。
1.5 统计学处理
2 结果
2.1 MP-DNA和MP-IgM检测阳性率比较 MP-DNA检测阳性率为57.07%（113/198），MP-IgM检测阳性率为47.47%（94/198），两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。
2.2 两组MP-DNA和MP-IgM检测阳性率比较 A组MP-DNA阳性率明显高于同组MP-IgM阳性率，差异有统计学意义（P<0.01）；B组MP-DNA和MP-IgM阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
3 讨论
支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，是介于细菌和病毒之间能在无活性细胞的人工培养基上生长繁殖的最小微生物，支原体肺炎主要通过飞沫传播，潜伏期可达2～3周[5]。近几年来，MP感染所致的呼吸道疾病逐年增多，非流行年份占小儿肺炎病因的10%～20%，在流行年份可达30%，并且每隔4～6年发生1次地区性流行[6-8]。学龄儿童及婴幼儿普遍易感。临床表现多种多样，病情轻重不等，病程长，易反复，肺外并发症较多见[1]。因其对常用抗生素不敏感，经验用药易延误病情，增加患儿痛苦和加重经济负担，因此早期诊断对临床的治疗尤为重要。目前，临床上用于MP感染早期检测的实验室方法有咽拭子聚合酶链反应（PCR）法测MP-DNA和血清间接免疫荧光法（IIFA）测MP-IgM，具有敏感度高、特异性强、操作简便快速的特点，可作为早期诊断肺炎支原体感染的客观指标，适合临床实验室应用[9-10]。
本研究结果显示，198例患儿，咽拭子PCR法测MP-DNA阳性率57.07%，IIFA法测血清MP-IgM阳性率47.47%，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。这是因为血清MP-IgM检测受病程影响较大，MP感染后刺激机体产生IgM抗体，发病后约7 d可在血清中检出，3～6周达高峰，之后逐渐消失。PCR技术检测MP-DNA的方法，是一种体外扩增特异DNA片段的新技术，它可以在短时间内使极微量的核酸片断扩增至数百万个拷贝[11-12]，具有特异性强、灵敏度高和简便快捷的优点，检测结果不受病程影响，在疾病早期即可检出，从而明确诊断。
本研究结果表明，A组（0～3岁）中咽拭子PCR测MP-DNA的阳性率明显高于肺炎支原体 MP-IgM的检测（P<0.01）。这是因为婴幼儿自身免疫系统尚不完善，不能对病原体产生正常免疫应答，在MP感染情况下也可不产生MP-IgM抗体或者感染MP后因MP-IgM抗体效价较低不易被检出，导致漏诊。而分子生物学方法检测则受年龄的影响小[13]。本研究中0～3岁患儿MP-IgM阳性率仅25.33%，远低于MP-DNA阳性率48.00%。对此年龄段患儿应首选咽拭子PCR法检测MP–DNA，不仅取样方便，无创伤，且检出率较高。B组（3～12岁）中咽拭子PCR测MP-DNA阳性率62.60%，MP-IgM阳性率60.98%，两者比较差异无统计学意义（P>0.05）。PCR方法虽具有很高的敏感性，但如实验室质控不严易出现污染导致假阳性，同时由于目前MP在呼吸道的携带状况尚不明确，也没有一个确切的域值可以区分MP在呼吸道的携带与感染，因此仅依据PCR阳性结果进行诊断可能高估MP的感染率[14-15]。相对而言IIFA特异性很高，检测结果阳性基本可以确定为MP感染。 综上所述，PCR法和IIFA法检测MP各有其特点，如能联合应用两种方法用于MP感染的早期检测，不但有利于疾病的诊断，而且可以有效地避免漏检，提高检测的准确性，为临床医生提供快速可靠的检验依据。
参考文献
[1]倪语星，尚红.临床微生物学与检验[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2007：304-308.
[2] Morozumi M，Ito A，Murayama S Y，et al.Assessment of real-time PCR for diagnosis of mycoplasma pneumoniae pneumonia in pediatric patients[J].Can J Microbiol，2006，52（2）：125-129.
[3]沈晓明，王卫平.儿科学[M].第7版.北京：人民卫生出版社，2008：208.
[4]刘群，袁成远.小儿肺炎支原体肺炎176例临床分析[J].实用医院临床杂志，2009，6（5）：91-92.
[5]邱细梅，丘海轶，张育娟.深圳市光明新区呼吸道感染患儿肺炎支原体抗体检测结果分析[J].中国医学创新，2012，9（21）：81-82.
[6]吴晓明，王小燕.肺炎支原体咽拭子培养诊断儿童肺炎支原体感染醮临床分析[J].中国当代医药，2009，16（21）：58-59.
[7]杨春.儿童肺炎支原体检测方法和感染状况的分析[J].中外医学研究，2011，9（27）：55-56.
[8]石利，杜雪飞，洪镭，等.一起聚集性肺炎疫情病原的快速实验室诊断与分析[J].中国医学创新，2012，9（26）：90-91.
[9]柳文菊，汪功文，刘学政，等.呼吸道感染患儿肺炎支原体IgM抗体与DNA检测结果分析[J].中华实用诊断与治疗杂志，2012，26（1）：63-64.
[10]王涛.肺炎支原体不同检测方法的比对分析[J].检验医学，2008，23（2）：137-141.
[11] Pitcher D，Chalker V J，Sheppard C，et al.Real-time detection of Mycoplasma pneumoniae in respiratory samples with an internal processing control[J].J Med Microbiol，2006，55（2）：149-155.
[12] Nilsson A C，Bj?rkman P，Persson K.Polymerase chain reaction is superior to serology for the diagnosis of acute mycoplasma pneumoniae infection and reveals a high rate of persistent infection[J].BMC Microbiol，2008，8（1）：93.
[13]方红，杨雪香，陈冬莲.不同年龄段儿童呼吸道感染肺炎支原体IgM与DNA的相关性研究[J].中华医院感染学杂志，2007，17（8）：1024-1025.
[14]赵阅，孙红妹.肺炎支原体实验诊断技术现状及发展[J].国际呼吸杂志，2009，29（5）：304-308.
[15] Ursi D，Ieven M，Noordhoek G T，et al.An interlaboratory comparison for the detection of mycoplasma pneumoniae in respiratory samples by the polymerase chain reaction[J].J Microbiol Methods，2003，53（3）：289-294.
（收稿日期：2014-01-13） （本文编辑：欧丽）
【关键词】 肺炎支原体； 聚合酶链反应； 间接免疫荧光法； 肺炎支原体抗体
肺炎支原体（mycoplasma pneumoniae，MP）是小儿呼吸道感染的常见病原体之一，主要通过呼吸道传染，临床表现多种多样，以呼吸道感染最为多见，并可引起全身各脏器损害[1]。MP的实验室检测方法有很多，近年来发展的咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）法均具有快速、敏感性高的优点[2]。为了客观评价这两种方法的异同，本研究对198例疑似肺炎支原体肺炎患儿分别采集咽拭子和血清同时用咽拭子聚合酶链反应（PCR）法和血清间接免疫荧光法（IIFA）检测MP，现将结果报告如下。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选取本院儿科收治的疑似MP感染的急性呼吸道感染患儿198例，年龄0～12岁，根据年龄将其分为两组：A组（0～3岁，n=75）、B组（3～12岁，n=123）。两组患者一般资料比较差异无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 仪器与试剂 杭州博日line gene PCR扩增仪，ZEISS型荧光显微镜。PCR法试剂盒由凯杰生物工程有限公司生产提供；IIFA法检测试剂盒由西班牙VIRCELL公司生产提供。
1.3 方法 用灭菌棉签采集受试者咽部样本用PCR法检测MP-DNA，同时采集患儿静脉全血，常规分离血清后用IIFA 法检测MP-IgM。操作方法均严格按照说明书进行。
1.4 小儿肺炎支原体肺炎临床诊断标准 持续剧烈咳嗽；全身症状比胸部体征明显；X射线所见较体征显著，胸片可见两肺均匀一致的片状阴影成似大叶性肺炎改变，肺门阴影增浓；白细胞计数正常或稍高，血沉多增快；应用大环内酯类效果好，其他抗生素如青霉素、头孢无效[3-4]。
1.5 统计学处理
2 结果
2.1 MP-DNA和MP-IgM检测阳性率比较 MP-DNA检测阳性率为57.07%（113/198），MP-IgM检测阳性率为47.47%（94/198），两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。
2.2 两组MP-DNA和MP-IgM检测阳性率比较 A组MP-DNA阳性率明显高于同组MP-IgM阳性率，差异有统计学意义（P<0.01）；B组MP-DNA和MP-IgM阳性率比较差异无统计学意义（P>0.05），见表1。
3 讨论
支原体是一类缺乏细胞壁的原核细胞型微生物，是介于细菌和病毒之间能在无活性细胞的人工培养基上生长繁殖的最小微生物，支原体肺炎主要通过飞沫传播，潜伏期可达2～3周[5]。近几年来，MP感染所致的呼吸道疾病逐年增多，非流行年份占小儿肺炎病因的10%～20%，在流行年份可达30%，并且每隔4～6年发生1次地区性流行[6-8]。学龄儿童及婴幼儿普遍易感。临床表现多种多样，病情轻重不等，病程长，易反复，肺外并发症较多见[1]。因其对常用抗生素不敏感，经验用药易延误病情，增加患儿痛苦和加重经济负担，因此早期诊断对临床的治疗尤为重要。目前，临床上用于MP感染早期检测的实验室方法有咽拭子聚合酶链反应（PCR）法测MP-DNA和血清间接免疫荧光法（IIFA）测MP-IgM，具有敏感度高、特异性强、操作简便快速的特点，可作为早期诊断肺炎支原体感染的客观指标，适合临床实验室应用[9-10]。
本研究结果显示，198例患儿，咽拭子PCR法测MP-DNA阳性率57.07%，IIFA法测血清MP-IgM阳性率47.47%，两者比较差异有统计学意义（P<0.01）。这是因为血清MP-IgM检测受病程影响较大，MP感染后刺激机体产生IgM抗体，发病后约7 d可在血清中检出，3～6周达高峰，之后逐渐消失。PCR技术检测MP-DNA的方法，是一种体外扩增特异DNA片段的新技术，它可以在短时间内使极微量的核酸片断扩增至数百万个拷贝[11-12]，具有特异性强、灵敏度高和简便快捷的优点，检测结果不受病程影响，在疾病早期即可检出，从而明确诊断。
本研究结果表明，A组（0～3岁）中咽拭子PCR测MP-DNA的阳性率明显高于肺炎支原体 MP-IgM的检测（P<0.01）。这是因为婴幼儿自身免疫系统尚不完善，不能对病原体产生正常免疫应答，在MP感染情况下也可不产生MP-IgM抗体或者感染MP后因MP-IgM抗体效价较低不易被检出，导致漏诊。而分子生物学方法检测则受年龄的影响小[13]。本研究中0～3岁患儿MP-IgM阳性率仅25.33%，远低于MP-DNA阳性率48.00%。对此年龄段患儿应首选咽拭子PCR法检测MP–DNA，不仅取样方便，无创伤，且检出率较高。B组（3～12岁）中咽拭子PCR测MP-DNA阳性率62.60%，MP-IgM阳性率60.98%，两者比较差异无统计学意义（P>0.05）。PCR方法虽具有很高的敏感性，但如实验室质控不严易出现污染导致假阳性，同时由于目前MP在呼吸道的携带状况尚不明确，也没有一个确切的域值可以区分MP在呼吸道的携带与感染，因此仅依据PCR阳性结果进行诊断可能高估MP的感染率[14-15]。相对而言IIFA特异性很高，检测结果阳性基本可以确定为MP感染。 综上所述，PCR法和IIFA法检测MP各有其特点，如能联合应用两种方法用于MP感染的早期检测，不但有利于疾病的诊断，而且可以有效地避免漏检，提高检测的准确性，为临床医生提供快速可靠的检验依据。
参考文献
[1]倪语星，尚红.临床微生物学与检验[M].第4版.北京：人民卫生出版社，2007：304-308.
[2] Morozumi M，Ito A，Murayama S Y，et al.Assessment of real-time PCR for diagnosis of mycoplasma pneumoniae pneumonia in pediatric patients[J].Can J Microbiol，2006，52（2）：125-129.
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[9]柳文菊，汪功文，刘学政，等.呼吸道感染患儿肺炎支原体IgM抗体与DNA检测结果分析[J].中华实用诊断与治疗杂志，2012，26（1）：63-64.
[10]王涛.肺炎支原体不同检测方法的比对分析[J].检验医学，2008，23（2）：137-141.
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[12] Nilsson A C，Bj?rkman P，Persson K.Polymerase chain reaction is superior to serology for the diagnosis of acute mycoplasma pneumoniae infection and reveals a high rate of persistent infection[J].BMC Microbiol，2008，8（1）：93.
[13]方红，杨雪香，陈冬莲.不同年龄段儿童呼吸道感染肺炎支原体IgM与DNA的相关性研究[J].中华医院感染学杂志，2007，17（8）：1024-1025.
[14]赵阅，孙红妹.肺炎支原体实验诊断技术现状及发展[J].国际呼吸杂志，2009，29（5）：304-308.
[15] Ursi D，Ieven M，Noordhoek G T，et al.An interlaboratory comparison for the detection of mycoplasma pneumoniae in respiratory samples by the polymerase chain reaction[J].J Microbiol Methods，2003，53（3）：289-294.
（收稿日期：2014-01-13） （本文编辑：欧丽）