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摘要水貂阿留申病是由水貂阿留申病毒引起的自身免疫性疾病，目前尚无有效疫苗，每年结合打皮期筛查淘汰病貂是该病防控的主要手段。目前，水貂阿留申病的主要诊断方法是依据临床症状和血清的对流免疫电泳检测。对流免疫电泳需要在实验室内进行，使用范围局限。综述了国外该病诊断的最新研究进展，以期为该病诊断技术的开发提供思路。
关键词水貂阿留申病；诊断技术；对流免疫电泳
中图分类号S865.2+2文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-156-02
水貂阿留申病（Aleutian disease，AD）是由细小病毒科阿留申病毒属的水貂阿留申病毒（Aleutian disease virus，ADV）感染引起的。水貂发病的症状与病毒和动物的自身情况相关。不同的病毒毒株，动物的不同基因型和年龄表现的症状表现不同。经典的AD症状在成年水貂表现为自身免疫综合症，患病水貂高r球蛋白血症、肾小球肾炎、动脉血管炎，水貂繁殖能力大大下降。幼貂常发生急性间质性肺炎。ADV 可以感染多种动物，如雪貂、蓝狐、貉子、浣熊、灰狐、水獭等[1-5]。国外有饲养场工人感染ADV最终表现为经典的ADV临床症状并死亡的报道[6]。
诊断是防控该病的重中之重。阿留申病患病水貂临床表现为消瘦，口渴。通常依据症状淘汰病貂，确诊则需要在实验室进行对流免疫电泳（Counter immuno electrophoresis，CIEP）检测。CIEP是国内外公认的ADV诊断方法。但是，CIEP不利于临床的推广和实现样品的高通量检测，近年来，国外学者报道了PCR、荧光定量PCR和ELISA 等诊断方法，这些方法突破了CIEP诊断的局限。笔者对ADV的最新研究技术进行了综述。
1AD抗体鉴定
AD抗体鉴定主要分特异性试验和非特异性试验。非特异性试验有碘凝集试验、血清蛋白电泳和戊二醛试验。这些方法常常造成假阳性结果，导致水貂误杀。特异性试验主要有间接免疫荧光、补体固定和对流免疫电泳试验CIEP。CIEP 试验最早在20世纪70年代建立，是诊断AD的国际公认方法，CIEP 诊断抗原主要采用感染动物的脏器研磨获得。从20世纪80年代开始，抗原的制备采用可传代的ADVG株感染CRFK细胞进行制备。为了提高CIEP试验的敏感性和特异性，又陆续对CIEP试验进行改进。添加剂CIEP及火箭CIEP等技术相继出现。最敏感的是逆流线吸收免疫电泳（CCLAIE），对3 321份样品进行检测，结果表明CIEP与CCLAIE相比，试验的敏感性为79%，特异性为99%，CCLAIE检测的抗体滴度为1∶4 096，远高于CIEP（1∶256）[7]。
2PCR法
ADV基因组全长近5 kB，编码结构蛋白VP1，VP2和非结构蛋白NS1、NS2、NS3。在VP2和NS基因上存在高变区，依据VP2基因高变区和NS基因高变区分别可以给水貂分为3个型和4个型[8-9]。以高变区序列为基础，Saifuddin[6]建立了诊断ADV和FADV的限制性内切酶诊断方法。1996年，Qie 应用PCR 扩增VP2基因的高变区序列，发现浣熊和臭鼬感染水貂阿留申病毒[10]。2013年，张蕾等利用PCR技术首次发现国内貉感染水貂阿留申病毒[11]。在诊断AD方面，Bloom[12]利用PCR鉴定了97份样品，与CIEP诊断的结果比对发现，对流免疫电泳诊断样品的阳性率为97%，而PCR诊断样品的阳性率为62%。这种差异的产生可能是由于病毒感染本身的特征引起的，病毒感染动物呈现血清学阳性，病毒学阴性。
2011年，TrineH.Jensen[13]比对了PCR和CIEP 2种方法检测ADV的差异。在55个已知感染ADV和8个未感染ADV的农场，共采集299份水貂脾脏和淋巴结及血清样品。结果表明，与CIEP相比PCR诊断的敏感性为94.7%，特异性为97.9%。PCR与CIEP诊断方法具有较高的一致性。
3荧光定量PCR
2014年，Alberto Prietoa 建立了ADV实时定量PCR方法，该方法有利于分析ADV的传播途径，从10 个农场选取了79例临床环境样品，样品采集广泛，包括饲养场排放的废水、养殖区工作人员的脚套、衣物、饲料堆积的仓库、动物存放的笼壁、工作人员使用的餐厅及会议区、运送饲料的交通工具、环境中土壤的表面和运输卡车经过的车辙等。结果表明，已确定感染的饲养场中93.9%的样品呈现ADV阳性。研究还发现，已发病的饲养场和未发病的饲养场存在人携带传播病原体的因素。在直接接触感染动物的器具和衣物表面的ADV的含量远大于环境中其他的样品（衣物、鞋套和饲养场使用的交通工具）对ADV的传播都有重要的作用。此外，PCR发现剖检的动物器官中带毒，但PCR检测发现相应动物粪便为阴性，说明感染的动物粪便的排毒是间断的，即便是粪便检测结果提示PCR结果呈阳性，也不能说明水貂呈现致病状态。因此，不能通过PCR检测动物粪便确定动物是否发生感染[14]。荧光定量PCR检测方法的建立为评估ADV 的传播途径提供了基础信息，有利于了解病原体在环境中的分布和评估病毒感染的高危因素，为传统的根除ADV计划提供了准确的临床理论数据和资料。
4ELISA法
1982年，Wright RF[15] 报道了以氟碳灭活的ADV抗原开发的ELISA试剂盒，在诊断进行性的感染水貂时敏感性很高，但非进行性ADV病貂的感染性低。ELISA在检测ADV方面不如CIEP试验有效。
2009年，Anna Knuuttila[16]利用昆虫杆状病毒系统在SF9细胞中表达了一ADV野毒株的VP2蛋白，并验证以之为抗原CIEP试验的检测效果，结果表明与传统商业抗原相比，该抗原诊断AD的敏感性和特异性为100%。利用重组蛋白为抗原，建立了ADV的ELISA 诊断方法。共采集316份血清样品，对重组蛋白进行CIEP检测，结果表明211份样品为ADV阴性，105份样品ADV阳性。重组蛋白ELISA检测结果表明，206份样品为阴性，105份样品为阳性。以重组蛋白为基础的 ELISA法与CIEP相比，诊断ADV的敏感性为99%，特异性为97%。二者具有较好的一致性。 2013年，Anna MariaAnder[17]分别用以美国ADVG为抗原开发的ELISA试剂盒和Anna Knuuttila表达的重组蛋白建立了ELISA诊断方法，并对比了2种ELISA方法检测ADV的差异，发现当应用CIEP阴性样品的OD值加上3个标准方差作为cutoff 值时，重组蛋白为基础的ELISA与CIEP相比诊断样品的敏感性为99.7%，特异性为98.3%。当以说明书推荐的阴性对照为cutoff值，ADVG株抗原为基础的ELISA与CIEP试验相比诊断的敏感性为54.3%，特异性为93.2%。采用CIEP 阴性样品的OD值加上3个标准方差作为cutoff值时，诊断的敏感性为37.6%，特异性为98.3%。因此，以商业抗原为基础的ELISA试验敏感性较低。
2014年，Rebekka DamTuxen[18]对比了以丹麦的ADVG为抗原建立的ELISA方法和CIEP试验的敏感性和特异性，共采集3 810份血清样品，ELISA试验与CIEP试验相比敏感性更高，特异性略低。ELISA试验可以实现自动化检测，每天可以检测38 000份血清样品。
2014年，Anna MariaAnder[19]报道了芬兰应用全自动的ELISA方法在国内实现高通量的ADV血清检测，每年可以检测3 000 000～4 000 000份样品。与CIEP试验相比，全自动ELISA方法的敏感性为96.2%，特异性为98.4%。CIEP与ELISA试验具有很高的一致性，Kappa值为0.976，总体的一致性为98.8%。目前，丹麦也实现了自动化ELISA检测ADV的服务。
5试纸条
目前，美国农场已应用胶体金诊断试纸诊断ADV感染，但未见到有关报道。徐磊[20]利用原核表达系统表达ADV病毒结构蛋白VP2的部分基因片段，并以之为基础建立了诊断ADV的胶体金侧向层析诊断方法。
6小结
综上所述，CIEP是诊断水貂阿留申病的国内外公认标准，防控该病的主要手段是对该疾病的诊断，在水貂引种时检测动物带毒情况；每年结合打皮期，诊断淘汰病貂，并对环境进行消毒，这些措施虽然有效延缓了ADV的传播进程，但ADV仍然频繁出现。PCR方法的出现弥补了CIEP诊断方法的漏诊，qPCR方法的建立有利于评估ADV感染的可能途径，试纸条方法有利于临床ADV快速诊断，ELISA方法实现了ADV的高通量自动化诊断。国内亟需开发有自主知识产权的ADV诊断的新产品。
参考文献
[1] ALEXANDERSEN S， JENSEN A U， HANSEN M，et al.Experimental transmission of Aleutian disease virus（ADV）to different animal species[J].Acta Pathol Microbiol Immunol Scand B，1985，93（3）：195-200.
[2] INGRAM D G，CHO H J.Aleutian disease in mink：virology，immunology and pathogenesis[J].J Rheumatol，1974，1（1）：74-92.
[3] KENYON A J， KENYON B J，HAHN E C.Protides of the Mustelidae：immunoresponse of mustelids to Aleutian mink disease virus[J].Am J Vet Res，1978，39（6）：1011-1015.
[4] LI L，PESAVENTO P A，WOODS L，et al.Novel amdovirus in gray foxes[J].Emerg Infect Dis，2011，17（10）：1876-1878.
[5] MURAKAMI M， MATSUBA C， UNE Y，et al.Nucleotide sequence and polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism analyses of Aleutian disease virus in ferrets in Japan[J].J Vet Diagn Invest，2001，13（4）：337-340.
[6] JEPSEN J R， D’AMORE F， BAANDRUP U，et al.Aleutian mink disease virus and humans[J].Emerg Infect Dis，2009，15（12）：2040-2042.
[7] AASTED B， ALEXANDERSEN S， COHN A，et al.Counter current line absorption immunoelectrophoresis in an alternative diagnostic screening test to counter current immunoelectrophoresis in Aleutian disease（AD）eradication programs[J].Acta Vet Scand，1986，27（3）：410-420.
[8] BLOOM M E， ALEXANDERSEN S， PERRYMAN S，et al.Nucleotide sequence and genomic organization of Aleutian mink disease parvovirus（ADV）：sequence comparisons between a nonpathogenic and a pathogenic strain of ADV[J].J Virol，1988，62（8）：2903-2915. [9] OLOFSSON A， MITTELHOLZER C， TREIBERG BERNDTSSON L，et al.Unusual，high genetic diversity of Aleutian mink disease virus[J].J Clin Microbiol，1999，37（12）：4145-4149.
[10] OIE K L，DURRANT G，WOLFINBARGER J B，et al.The relationship between capsid protein（VP2）sequence and pathogenicity of Aleutian mink disease parvovirus（ADV）：a possible role for raccoons in the transmission of ADV infections[J].J Virol，1996，70（2）：852-861.
[11] 张蕾，胡博，王振军，等.我国首次证实貉感染水貂阿留申病毒[J].病毒学报，2013，29（6）：680.
[12] BLOOM M E，MARTIN D A，OIE K L，et al.Expression of Aleutian mink disease parvovirus capsid proteins in defined segments：localization of immunoreactive sites and neutralizing epitopes to specific regions[J].J Virol，1997，71（1）：705-714.
[13] JENSEN T H， CHRISTENSEN L S， CHRIEL M，et al.Implementation and validation of a sensitive PCR detection method in the eradication campaign against Aleutian mink disease virus[J].J Virol Methods，2011，171（1）：81-85.
[14] PRIETO A，DIAZCAO J M，FERNANDEZANTONIO R，et al.Application of realtime PCR to detect Aleutian Mink Disease Virus on environmental farm sources[J].Vet Microbiol，2014，173（3/4）：355-359.
关键词水貂阿留申病；诊断技术；对流免疫电泳
中图分类号S865.2+2文献标识码A文章编号0517-6611（2015）06-156-02
水貂阿留申病（Aleutian disease，AD）是由细小病毒科阿留申病毒属的水貂阿留申病毒（Aleutian disease virus，ADV）感染引起的。水貂发病的症状与病毒和动物的自身情况相关。不同的病毒毒株，动物的不同基因型和年龄表现的症状表现不同。经典的AD症状在成年水貂表现为自身免疫综合症，患病水貂高r球蛋白血症、肾小球肾炎、动脉血管炎，水貂繁殖能力大大下降。幼貂常发生急性间质性肺炎。ADV 可以感染多种动物，如雪貂、蓝狐、貉子、浣熊、灰狐、水獭等[1-5]。国外有饲养场工人感染ADV最终表现为经典的ADV临床症状并死亡的报道[6]。
诊断是防控该病的重中之重。阿留申病患病水貂临床表现为消瘦，口渴。通常依据症状淘汰病貂，确诊则需要在实验室进行对流免疫电泳（Counter immuno electrophoresis，CIEP）检测。CIEP是国内外公认的ADV诊断方法。但是，CIEP不利于临床的推广和实现样品的高通量检测，近年来，国外学者报道了PCR、荧光定量PCR和ELISA 等诊断方法，这些方法突破了CIEP诊断的局限。笔者对ADV的最新研究技术进行了综述。
1AD抗体鉴定
AD抗体鉴定主要分特异性试验和非特异性试验。非特异性试验有碘凝集试验、血清蛋白电泳和戊二醛试验。这些方法常常造成假阳性结果，导致水貂误杀。特异性试验主要有间接免疫荧光、补体固定和对流免疫电泳试验CIEP。CIEP 试验最早在20世纪70年代建立，是诊断AD的国际公认方法，CIEP 诊断抗原主要采用感染动物的脏器研磨获得。从20世纪80年代开始，抗原的制备采用可传代的ADVG株感染CRFK细胞进行制备。为了提高CIEP试验的敏感性和特异性，又陆续对CIEP试验进行改进。添加剂CIEP及火箭CIEP等技术相继出现。最敏感的是逆流线吸收免疫电泳（CCLAIE），对3 321份样品进行检测，结果表明CIEP与CCLAIE相比，试验的敏感性为79%，特异性为99%，CCLAIE检测的抗体滴度为1∶4 096，远高于CIEP（1∶256）[7]。
2PCR法
ADV基因组全长近5 kB，编码结构蛋白VP1，VP2和非结构蛋白NS1、NS2、NS3。在VP2和NS基因上存在高变区，依据VP2基因高变区和NS基因高变区分别可以给水貂分为3个型和4个型[8-9]。以高变区序列为基础，Saifuddin[6]建立了诊断ADV和FADV的限制性内切酶诊断方法。1996年，Qie 应用PCR 扩增VP2基因的高变区序列，发现浣熊和臭鼬感染水貂阿留申病毒[10]。2013年，张蕾等利用PCR技术首次发现国内貉感染水貂阿留申病毒[11]。在诊断AD方面，Bloom[12]利用PCR鉴定了97份样品，与CIEP诊断的结果比对发现，对流免疫电泳诊断样品的阳性率为97%，而PCR诊断样品的阳性率为62%。这种差异的产生可能是由于病毒感染本身的特征引起的，病毒感染动物呈现血清学阳性，病毒学阴性。
2011年，TrineH.Jensen[13]比对了PCR和CIEP 2种方法检测ADV的差异。在55个已知感染ADV和8个未感染ADV的农场，共采集299份水貂脾脏和淋巴结及血清样品。结果表明，与CIEP相比PCR诊断的敏感性为94.7%，特异性为97.9%。PCR与CIEP诊断方法具有较高的一致性。
3荧光定量PCR
2014年，Alberto Prietoa 建立了ADV实时定量PCR方法，该方法有利于分析ADV的传播途径，从10 个农场选取了79例临床环境样品，样品采集广泛，包括饲养场排放的废水、养殖区工作人员的脚套、衣物、饲料堆积的仓库、动物存放的笼壁、工作人员使用的餐厅及会议区、运送饲料的交通工具、环境中土壤的表面和运输卡车经过的车辙等。结果表明，已确定感染的饲养场中93.9%的样品呈现ADV阳性。研究还发现，已发病的饲养场和未发病的饲养场存在人携带传播病原体的因素。在直接接触感染动物的器具和衣物表面的ADV的含量远大于环境中其他的样品（衣物、鞋套和饲养场使用的交通工具）对ADV的传播都有重要的作用。此外，PCR发现剖检的动物器官中带毒，但PCR检测发现相应动物粪便为阴性，说明感染的动物粪便的排毒是间断的，即便是粪便检测结果提示PCR结果呈阳性，也不能说明水貂呈现致病状态。因此，不能通过PCR检测动物粪便确定动物是否发生感染[14]。荧光定量PCR检测方法的建立为评估ADV 的传播途径提供了基础信息，有利于了解病原体在环境中的分布和评估病毒感染的高危因素，为传统的根除ADV计划提供了准确的临床理论数据和资料。
4ELISA法
1982年，Wright RF[15] 报道了以氟碳灭活的ADV抗原开发的ELISA试剂盒，在诊断进行性的感染水貂时敏感性很高，但非进行性ADV病貂的感染性低。ELISA在检测ADV方面不如CIEP试验有效。
2009年，Anna Knuuttila[16]利用昆虫杆状病毒系统在SF9细胞中表达了一ADV野毒株的VP2蛋白，并验证以之为抗原CIEP试验的检测效果，结果表明与传统商业抗原相比，该抗原诊断AD的敏感性和特异性为100%。利用重组蛋白为抗原，建立了ADV的ELISA 诊断方法。共采集316份血清样品，对重组蛋白进行CIEP检测，结果表明211份样品为ADV阴性，105份样品ADV阳性。重组蛋白ELISA检测结果表明，206份样品为阴性，105份样品为阳性。以重组蛋白为基础的 ELISA法与CIEP相比，诊断ADV的敏感性为99%，特异性为97%。二者具有较好的一致性。 2013年，Anna MariaAnder[17]分别用以美国ADVG为抗原开发的ELISA试剂盒和Anna Knuuttila表达的重组蛋白建立了ELISA诊断方法，并对比了2种ELISA方法检测ADV的差异，发现当应用CIEP阴性样品的OD值加上3个标准方差作为cutoff 值时，重组蛋白为基础的ELISA与CIEP相比诊断样品的敏感性为99.7%，特异性为98.3%。当以说明书推荐的阴性对照为cutoff值，ADVG株抗原为基础的ELISA与CIEP试验相比诊断的敏感性为54.3%，特异性为93.2%。采用CIEP 阴性样品的OD值加上3个标准方差作为cutoff值时，诊断的敏感性为37.6%，特异性为98.3%。因此，以商业抗原为基础的ELISA试验敏感性较低。
2014年，Rebekka DamTuxen[18]对比了以丹麦的ADVG为抗原建立的ELISA方法和CIEP试验的敏感性和特异性，共采集3 810份血清样品，ELISA试验与CIEP试验相比敏感性更高，特异性略低。ELISA试验可以实现自动化检测，每天可以检测38 000份血清样品。
2014年，Anna MariaAnder[19]报道了芬兰应用全自动的ELISA方法在国内实现高通量的ADV血清检测，每年可以检测3 000 000～4 000 000份样品。与CIEP试验相比，全自动ELISA方法的敏感性为96.2%，特异性为98.4%。CIEP与ELISA试验具有很高的一致性，Kappa值为0.976，总体的一致性为98.8%。目前，丹麦也实现了自动化ELISA检测ADV的服务。
5试纸条
目前，美国农场已应用胶体金诊断试纸诊断ADV感染，但未见到有关报道。徐磊[20]利用原核表达系统表达ADV病毒结构蛋白VP2的部分基因片段，并以之为基础建立了诊断ADV的胶体金侧向层析诊断方法。
6小结
综上所述，CIEP是诊断水貂阿留申病的国内外公认标准，防控该病的主要手段是对该疾病的诊断，在水貂引种时检测动物带毒情况；每年结合打皮期，诊断淘汰病貂，并对环境进行消毒，这些措施虽然有效延缓了ADV的传播进程，但ADV仍然频繁出现。PCR方法的出现弥补了CIEP诊断方法的漏诊，qPCR方法的建立有利于评估ADV感染的可能途径，试纸条方法有利于临床ADV快速诊断，ELISA方法实现了ADV的高通量自动化诊断。国内亟需开发有自主知识产权的ADV诊断的新产品。
参考文献
[1] ALEXANDERSEN S， JENSEN A U， HANSEN M，et al.Experimental transmission of Aleutian disease virus（ADV）to different animal species[J].Acta Pathol Microbiol Immunol Scand B，1985，93（3）：195-200.
[2] INGRAM D G，CHO H J.Aleutian disease in mink：virology，immunology and pathogenesis[J].J Rheumatol，1974，1（1）：74-92.
[3] KENYON A J， KENYON B J，HAHN E C.Protides of the Mustelidae：immunoresponse of mustelids to Aleutian mink disease virus[J].Am J Vet Res，1978，39（6）：1011-1015.
[4] LI L，PESAVENTO P A，WOODS L，et al.Novel amdovirus in gray foxes[J].Emerg Infect Dis，2011，17（10）：1876-1878.
[5] MURAKAMI M， MATSUBA C， UNE Y，et al.Nucleotide sequence and polymerase chain reaction/restriction fragment length polymorphism analyses of Aleutian disease virus in ferrets in Japan[J].J Vet Diagn Invest，2001，13（4）：337-340.
[6] JEPSEN J R， D’AMORE F， BAANDRUP U，et al.Aleutian mink disease virus and humans[J].Emerg Infect Dis，2009，15（12）：2040-2042.
[7] AASTED B， ALEXANDERSEN S， COHN A，et al.Counter current line absorption immunoelectrophoresis in an alternative diagnostic screening test to counter current immunoelectrophoresis in Aleutian disease（AD）eradication programs[J].Acta Vet Scand，1986，27（3）：410-420.
[8] BLOOM M E， ALEXANDERSEN S， PERRYMAN S，et al.Nucleotide sequence and genomic organization of Aleutian mink disease parvovirus（ADV）：sequence comparisons between a nonpathogenic and a pathogenic strain of ADV[J].J Virol，1988，62（8）：2903-2915. [9] OLOFSSON A， MITTELHOLZER C， TREIBERG BERNDTSSON L，et al.Unusual，high genetic diversity of Aleutian mink disease virus[J].J Clin Microbiol，1999，37（12）：4145-4149.
[10] OIE K L，DURRANT G，WOLFINBARGER J B，et al.The relationship between capsid protein（VP2）sequence and pathogenicity of Aleutian mink disease parvovirus（ADV）：a possible role for raccoons in the transmission of ADV infections[J].J Virol，1996，70（2）：852-861.
[11] 张蕾，胡博，王振军，等.我国首次证实貉感染水貂阿留申病毒[J].病毒学报，2013，29（6）：680.
[12] BLOOM M E，MARTIN D A，OIE K L，et al.Expression of Aleutian mink disease parvovirus capsid proteins in defined segments：localization of immunoreactive sites and neutralizing epitopes to specific regions[J].J Virol，1997，71（1）：705-714.
[13] JENSEN T H， CHRISTENSEN L S， CHRIEL M，et al.Implementation and validation of a sensitive PCR detection method in the eradication campaign against Aleutian mink disease virus[J].J Virol Methods，2011，171（1）：81-85.
[14] PRIETO A，DIAZCAO J M，FERNANDEZANTONIO R，et al.Application of realtime PCR to detect Aleutian Mink Disease Virus on environmental farm sources[J].Vet Microbiol，2014，173（3/4）：355-359.