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摘要：利用染色体步移技术，从花生品种鲁花14中克隆到716 bp的AhFAD2A基因启动子片段。序列分析表明，该启动子中含有多种种子特异性表达的元件，如GCN4基序、AGCCCA序列元件、Skn-1基序等，可能与AhFAD2A基因在种子中有较高的表达水平有关。启动子中预测的调控元件的功能还需进一步实验验证。
关键词：花生；AhFAD2A基因；启动子；调控元件分析
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0030-04
花生是重要的油料作物和经济作物，花生籽粒含油量约占种子干重的4427%～5386%[1]；而其储藏油脂中80%左右为不饱和脂肪酸（其中油酸36%～67%，亚油酸15%～43%），饱和脂肪酸仅占20%左右（其中棕榈酸6%～11%，硬脂酸2%～6%，花生酸5%～7%）[2～4]。花生籽粒油脂的品质是由脂肪酸的组成决定的，高油酸的花生稳定性好、营养价值高，对一些疾病有很好的预防作用。因此提高油酸的相对含量，增加油酸/亚油酸（O/L）的比值，已成为目前油料作物育种的重要内容，控制油酸向亚油酸转化的微粒体△12脂肪酸脱氢酶（delta 12 fatty acid desaturase， Δ12FAD或FAD2）成为一个研究重点。
启动子是基因的一个重要组成部分，控制基因转录水平的表达，对其功能的研究成为研究基因表达调控的重要内容。以往研究发现，在花生FAD2B基因编码区上游存在一个16 kb左右的内含子[3，5]，而本实验室前期的研究同样发现花生FAD2A和FAD2B基因编码区上游存在一个16 kb左右的内含子。但到目前为止对于花生AhFAD2基因内含子上游的启动子的研究尚未见报道。本研究利用前期克隆到的花生内含子序列设计特异性的引物，采用染色体步移的方法克隆了AhFAD2A基因的启动子，并利用数据库对启动子序列进行了分析，为下一步鉴定AhFAD2A启动子的功能研究奠定基础。
1材料与方法
11材料与试剂
花生品种：鲁花14（LH14）由山东省花生研究所提供；大肠杆菌（Escherichia coil） DH5α、克隆载体pEASY-T3 Cloning Kit为北京全式金生物技术有限公司产品。
植物基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；GenomeWalker Universal Kit试剂盒为Clontech公司产品；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit购自北京全式金公司；内切酶DraⅠ、EcoR V、PvuⅡ、StuⅠ、EcoRⅠ为宝生物工程（大连）有限公司产品；氨苄青霉素为北京索莱宝科技有限公司产品；其他试剂均为进口或国产分析纯。
12实验方法
121花生基因组DNA的提取取花生LH14幼嫩的叶片02 g，用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，取DNA样品用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，用紫外分光光度计检测样品浓度。
122DNA文库构建及启动子片段扩增分别用内切酶DraⅠ、EcoR V、PvuⅡ、StuⅠ酶切LH14花生基因组DNA，而后在末端连接上人工接头，构建获得4个基因文库LD、LE、LP和LS。
2结果与分析
21花生AhFAD2A基因启动子的克隆
第一步PCR扩增的产物用琼脂糖凝胶电泳检测（图1），4个不同模板反应体系的产物都有多条条带，但并无特异性的条带。因此对第一步的产物稀释100倍作为第二步的模板（D/E/S/P）。第二步PCR扩增后用琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现凝胶中有多条扩增较特异的条带（图2）。分别回收D、S扩增获得的较小条带，以及E与P中的全部条带，对回收的条带进行测序。序列分析发现，大部分序列都不符合要求，为非特异性扩增。只有以S为模板的产物序列与前期克隆到的碱基序列有300 bp重叠，序列大小为809 bp，去掉人工接头36 bp序列，克隆到序列为773 bp。
22AhFAD2A启动子序列预测分析
经过NCBI的BLAST比对后发现，克隆到的序列3′端与花生AhFAD2A基因组（GenBank： AF2487391） 序列的5′上游序列有70 bp的序列重合， 说明克隆到的773 bp序列是FAD2A的5′上游调控区序列。利用BDGP在线预测分析序列的转录起始位点为C，附近序列为AACAACTTAA（加粗的C为预测的转录起始位点）。因此克隆到的773 bp的序列有716 bp属于AhFAD2A启动子。
利用PlantCare和PLACE在线预测分析了AhFAD2A启动子的序列，并推断TATA框位于转录起始位点上游-32 bp处，离TATA框最近的CAAT盒则位于转录起始位点-260 bp处。
除了TATA框和CAAT盒，在克隆到的序列中还含有很多可以在种子中表达的启动子元件：（1）AGCCA序列元件，位于克隆到序列的-20 bp处，保守的序列模式为A（G/C/A）CCCA，能够提高种子贮藏蛋白的特异性表达[6]。（2）ACGT盒，位于-810 bp、-610 bp、-711 bp处，存在于多种植物种子贮藏蛋白基因启动子序列中，是种子特异性表达所需的一种调控元件[7]。（3）GCN4基序（-410 bp），以TGTGTCA序列存在，是胚乳中特异性表达所需要的顺式调控元件之一，大多数种子贮藏蛋白基因的启动子中存在该功能元件[8]。（4）Skn-1基序，以GTCAT序列存在于-104 bp处，是植物种子胚乳特异性表达所需要的重要顺式调控元件。（5）B盒是ACGTGG保守序列和G盒元件的复合体，是介导种子成熟阶段不可缺少的ABA应答元件（ABA response element，ABRE）[9]。此外，-304 bp处-300ELEMENT元件与-248 bp、-27 bp的SEF元件也是发育种子中特异性表达所需要的功能元件[10，11]。 植物激素在种子的发育阶段也起了很大的作用。种子发育早、中期的ABA水平控制着贮藏蛋白的积累，对于种子的发育有着很重要的作用。在克隆到的序列中含有很多的ABA应答元件。如：DPBF CORE（核心序列ACACNNGA）能与转录因子DPBF-1和DPBF-2结合，参与ABA的应答[12]；ABA响应元件ABRE，也是种子发育需要的重要功能元件[13]。CARE（CAACTC调控元件）调控GA诱导的水解酶的表达，是种子萌发必需的元件[14]。
综合上述分析表明，AhFAD2A启动子序列中有很多与种子蛋白表达相关的元件，这些元件在很多植物中被证明是种子蛋白积累所必需的，这与AhFAD2A在种子中有较强表达水平相一致。
除了上述元件外，AhFAD2A启动子序列中还含有很多其他的应答元件，如光应答元件I-box（736 bp、-548 bp）、热应答元件HSE（-306 bp、-403 bp）等等，它们都参与了不同组织、不同发育时期或不同生长条件下该基因的表达调控。3讨论
近年来在拟南芥、大豆、芝麻等多种植物中获得了FAD2基因序列。研究发现，不同物种FAD2基因组结构保守性很强，在不同植物5′上游调控区都含有1个靠近起始密码子ATG的内含子[15]，这些内含子对基因的表达也起一定的调控作用。Kim等[15]研究发现芝麻FAD2基因内含子的792～1 516区可以促进该基因的表达。近年来许多研究发现，内含子具有调控基因表达水平或产生不同的时空表达模式的作用[15～19]，到目前为止已通过实验验证的基因表达增强型内含子至少包括40个不同的成员[20]。Jeon 等[16]研究发现，水稻α-tubulin基因OsTubA1第一个内含子包含有调控该基因在根尖、幼叶和幼嫩的花中表达的信息或元件，缺失后不能在这些组织中表达。AhFAD2A基因在其5′非编码区也存在一个16 kb左右大小的内含子，该内含子是否也可以影响基因表达水平或时空表达模式还需要进一步的研究。
花生AhFAD2A基因在根、茎、叶、花和种子中均有表达，但在种子中表达水平较高。本研究获得的FAD2A基因716 bp启动子序列中含有很多与种子特异性表达相关的元件，这与AhFAD2A在种子中有较强表达水平相一致。但这些分析结果只是利用数据库预测的，要确定这些元件是否真正具有预测的功能必需经过实验的验证。通过数据库的预测可以提高实验的目的性，为进一步通过实验方法鉴定所含调控元件的功能提供重要参考。参考文献：
[1]万书波主编 花生品质学[M] 北京：中国农业科学技术出版社， 2005，2-10
[2]Moore K M， Knauft D A The inheritance of the high oleic acid in peanut[J] J Heredity， 1989， 80： 252-253
[3]Chu Y， Holbrook C C， Ozias-Akins P Two alleles of ahFAD2B control the the high oleic acid trait in cultivated peanut[J] Crop Sci， 2009， 49（6）： 2029-2036
[4]万书波 中国花生栽培学[M]上海：上海科学技术出版社， 2003，1-10
[5]Lopez Y， Nadaf H L， Smith O D Genetic factors influencing high oleic acid content in spanish market-type peanut cultivars[J] Crop Sci， 2000， 41： 51-56
[6]Chen Z L， Schuler M A， Beachy R N Functional analysis of regulatory elements in a plant embryo-specific gene[J] Proc Natl Acad Sci USA， 1986， 83（22）： 8560-8564
[7]Vincentz M， Leite A， Neshich G， et al ACGT and vicilin core sequences in a promoter domain required for seed-specific expression of a 2S storage protein gene are recognized by the opaque-2 regulatory protein[J] Plant Molecular Biology， 1997， 34： 879-889
[8]Wu C， Washlda H， Onodera Y， et al Quantitative nature of the prolamin-box，ACGT and AACA motifs in a rice glutelin gene promoter： minimal cis-element requirements for endosperm-specific gene expression [J] Plant J，2000， 23：415-421
[9]Ezcurra I， Ellerstrom M， Wycllffe P， et al Interaction between composite elements in the napA promoter： both the B-box ABA-responsive complex and the RY/G complex are necessary for seed-specific expression[J] Plant Mol Biol，1999 ， 40（4）： 699-709 [10]Stalberg K， Ellerstrom M， Ezcurra I， et alDisruption of an overlapping E-box/ABRE motif abolished high transcription of the napA storage-protein promoter in transgenic Brassica napus seeds[J] Planta，1996，199： 515-519
[11]Lessard P A， Allen R D， Bernier F，et alMultiple nuclear factors interact with upstream sequences of differentially regulated beta-conglycinin genes[J] Plant Mol Biol，1991， 16（3）： 397-413
[12]Kim S Y， Chung H J， Thomas T LIsolation of a novel class of bZIP transcription factors that interact with ABA-responsive and embryo-specification elements in the Dc3 promoter using a modified yeast one-hybrid system[J] Plant J， 1997， 11（6）：1237-1251
[13]Thomas M S， Flavell R BIdentification of an enhancer element for the endosperm-specific expression of high molecular weight glutenin[J] Plant Cell，1990， 2（12）： 1171-1180
[14]Sutoh K， Yamauchi DTwo cis-acting elements necessary and sufficient for gibberellin-upregulated proteinase expression in rice seeds[J] Plant J，2003， 34（5）： 635-645
[15]Kim M J， Kim H， Shin J S， et al Seed-specific expression of sesame microsomal oleic acid desaturase is controlled by combinatorial properties between negative cis-regulatory elements in the SeFAD2 promoter and enhancers in the 5′-UTR intron[J] Mol Genet Genomics，2006， 276（4）： 351-368
[16]Jeon J S， Lee S， Jung K H， et al Tissue-preferential expression of a rice α-tubulin gene， OsTubA1， mediated by the first intron[J] Plant Physiol， 2000， 123（3）： 1005-1014
[17]Rose A B， Elfersi T， Parra G，et al Promoter-proximal introns in Arabidopsis thaliana are enriched in dispersed signal and evelate gene expression[J] The Plant Cell， 2008， 20： 543-551
[18]Jeong Y M， Mun J H， Lee I，et al Distinct roles of the first introns on the expression of Arabidopsis profilin gene family members[J] Plant Physiol， 2006， 140： 196-209
[19]Gianì S， Altana A， Campanoni P，et al In transgenic rice， alpha- and beta-tubulin regulatory sequences control GUS amount and distribution through intron mediated enhancement and intron dependent spatial expression[J] Transgenic Res，2009， 18（2）： 151-162
[20]Morello L， Gianì S， Troina F，et al Testing the IMEter on rice introns and other aspects of intron-mediated enhancement of gene expression[J] J Exp Bot，2011， 62（2）： 533-544
关键词：花生；AhFAD2A基因；启动子；调控元件分析
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0030-04
花生是重要的油料作物和经济作物，花生籽粒含油量约占种子干重的4427%～5386%[1]；而其储藏油脂中80%左右为不饱和脂肪酸（其中油酸36%～67%，亚油酸15%～43%），饱和脂肪酸仅占20%左右（其中棕榈酸6%～11%，硬脂酸2%～6%，花生酸5%～7%）[2～4]。花生籽粒油脂的品质是由脂肪酸的组成决定的，高油酸的花生稳定性好、营养价值高，对一些疾病有很好的预防作用。因此提高油酸的相对含量，增加油酸/亚油酸（O/L）的比值，已成为目前油料作物育种的重要内容，控制油酸向亚油酸转化的微粒体△12脂肪酸脱氢酶（delta 12 fatty acid desaturase， Δ12FAD或FAD2）成为一个研究重点。
启动子是基因的一个重要组成部分，控制基因转录水平的表达，对其功能的研究成为研究基因表达调控的重要内容。以往研究发现，在花生FAD2B基因编码区上游存在一个16 kb左右的内含子[3，5]，而本实验室前期的研究同样发现花生FAD2A和FAD2B基因编码区上游存在一个16 kb左右的内含子。但到目前为止对于花生AhFAD2基因内含子上游的启动子的研究尚未见报道。本研究利用前期克隆到的花生内含子序列设计特异性的引物，采用染色体步移的方法克隆了AhFAD2A基因的启动子，并利用数据库对启动子序列进行了分析，为下一步鉴定AhFAD2A启动子的功能研究奠定基础。
1材料与方法
11材料与试剂
花生品种：鲁花14（LH14）由山东省花生研究所提供；大肠杆菌（Escherichia coil） DH5α、克隆载体pEASY-T3 Cloning Kit为北京全式金生物技术有限公司产品。
植物基因组DNA提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购自天根生化科技有限公司；GenomeWalker Universal Kit试剂盒为Clontech公司产品；EasyPure Plasmid MiniPrep Kit购自北京全式金公司；内切酶DraⅠ、EcoR V、PvuⅡ、StuⅠ、EcoRⅠ为宝生物工程（大连）有限公司产品；氨苄青霉素为北京索莱宝科技有限公司产品；其他试剂均为进口或国产分析纯。
12实验方法
121花生基因组DNA的提取取花生LH14幼嫩的叶片02 g，用植物基因组DNA提取试剂盒提取基因组DNA，取DNA样品用琼脂糖凝胶电泳检测其纯度，用紫外分光光度计检测样品浓度。
122DNA文库构建及启动子片段扩增分别用内切酶DraⅠ、EcoR V、PvuⅡ、StuⅠ酶切LH14花生基因组DNA，而后在末端连接上人工接头，构建获得4个基因文库LD、LE、LP和LS。
2结果与分析
21花生AhFAD2A基因启动子的克隆
第一步PCR扩增的产物用琼脂糖凝胶电泳检测（图1），4个不同模板反应体系的产物都有多条条带，但并无特异性的条带。因此对第一步的产物稀释100倍作为第二步的模板（D/E/S/P）。第二步PCR扩增后用琼脂糖凝胶电泳检测，结果发现凝胶中有多条扩增较特异的条带（图2）。分别回收D、S扩增获得的较小条带，以及E与P中的全部条带，对回收的条带进行测序。序列分析发现，大部分序列都不符合要求，为非特异性扩增。只有以S为模板的产物序列与前期克隆到的碱基序列有300 bp重叠，序列大小为809 bp，去掉人工接头36 bp序列，克隆到序列为773 bp。
22AhFAD2A启动子序列预测分析
经过NCBI的BLAST比对后发现，克隆到的序列3′端与花生AhFAD2A基因组（GenBank： AF2487391） 序列的5′上游序列有70 bp的序列重合， 说明克隆到的773 bp序列是FAD2A的5′上游调控区序列。利用BDGP在线预测分析序列的转录起始位点为C，附近序列为AACAACTTAA（加粗的C为预测的转录起始位点）。因此克隆到的773 bp的序列有716 bp属于AhFAD2A启动子。
利用PlantCare和PLACE在线预测分析了AhFAD2A启动子的序列，并推断TATA框位于转录起始位点上游-32 bp处，离TATA框最近的CAAT盒则位于转录起始位点-260 bp处。
除了TATA框和CAAT盒，在克隆到的序列中还含有很多可以在种子中表达的启动子元件：（1）AGCCA序列元件，位于克隆到序列的-20 bp处，保守的序列模式为A（G/C/A）CCCA，能够提高种子贮藏蛋白的特异性表达[6]。（2）ACGT盒，位于-810 bp、-610 bp、-711 bp处，存在于多种植物种子贮藏蛋白基因启动子序列中，是种子特异性表达所需的一种调控元件[7]。（3）GCN4基序（-410 bp），以TGTGTCA序列存在，是胚乳中特异性表达所需要的顺式调控元件之一，大多数种子贮藏蛋白基因的启动子中存在该功能元件[8]。（4）Skn-1基序，以GTCAT序列存在于-104 bp处，是植物种子胚乳特异性表达所需要的重要顺式调控元件。（5）B盒是ACGTGG保守序列和G盒元件的复合体，是介导种子成熟阶段不可缺少的ABA应答元件（ABA response element，ABRE）[9]。此外，-304 bp处-300ELEMENT元件与-248 bp、-27 bp的SEF元件也是发育种子中特异性表达所需要的功能元件[10，11]。 植物激素在种子的发育阶段也起了很大的作用。种子发育早、中期的ABA水平控制着贮藏蛋白的积累，对于种子的发育有着很重要的作用。在克隆到的序列中含有很多的ABA应答元件。如：DPBF CORE（核心序列ACACNNGA）能与转录因子DPBF-1和DPBF-2结合，参与ABA的应答[12]；ABA响应元件ABRE，也是种子发育需要的重要功能元件[13]。CARE（CAACTC调控元件）调控GA诱导的水解酶的表达，是种子萌发必需的元件[14]。
综合上述分析表明，AhFAD2A启动子序列中有很多与种子蛋白表达相关的元件，这些元件在很多植物中被证明是种子蛋白积累所必需的，这与AhFAD2A在种子中有较强表达水平相一致。
除了上述元件外，AhFAD2A启动子序列中还含有很多其他的应答元件，如光应答元件I-box（736 bp、-548 bp）、热应答元件HSE（-306 bp、-403 bp）等等，它们都参与了不同组织、不同发育时期或不同生长条件下该基因的表达调控。3讨论
近年来在拟南芥、大豆、芝麻等多种植物中获得了FAD2基因序列。研究发现，不同物种FAD2基因组结构保守性很强，在不同植物5′上游调控区都含有1个靠近起始密码子ATG的内含子[15]，这些内含子对基因的表达也起一定的调控作用。Kim等[15]研究发现芝麻FAD2基因内含子的792～1 516区可以促进该基因的表达。近年来许多研究发现，内含子具有调控基因表达水平或产生不同的时空表达模式的作用[15～19]，到目前为止已通过实验验证的基因表达增强型内含子至少包括40个不同的成员[20]。Jeon 等[16]研究发现，水稻α-tubulin基因OsTubA1第一个内含子包含有调控该基因在根尖、幼叶和幼嫩的花中表达的信息或元件，缺失后不能在这些组织中表达。AhFAD2A基因在其5′非编码区也存在一个16 kb左右大小的内含子，该内含子是否也可以影响基因表达水平或时空表达模式还需要进一步的研究。
花生AhFAD2A基因在根、茎、叶、花和种子中均有表达，但在种子中表达水平较高。本研究获得的FAD2A基因716 bp启动子序列中含有很多与种子特异性表达相关的元件，这与AhFAD2A在种子中有较强表达水平相一致。但这些分析结果只是利用数据库预测的，要确定这些元件是否真正具有预测的功能必需经过实验的验证。通过数据库的预测可以提高实验的目的性，为进一步通过实验方法鉴定所含调控元件的功能提供重要参考。参考文献：
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[14]Sutoh K， Yamauchi DTwo cis-acting elements necessary and sufficient for gibberellin-upregulated proteinase expression in rice seeds[J] Plant J，2003， 34（5）： 635-645
[15]Kim M J， Kim H， Shin J S， et al Seed-specific expression of sesame microsomal oleic acid desaturase is controlled by combinatorial properties between negative cis-regulatory elements in the SeFAD2 promoter and enhancers in the 5′-UTR intron[J] Mol Genet Genomics，2006， 276（4）： 351-368
[16]Jeon J S， Lee S， Jung K H， et al Tissue-preferential expression of a rice α-tubulin gene， OsTubA1， mediated by the first intron[J] Plant Physiol， 2000， 123（3）： 1005-1014
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