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摘要：以白金1号为试材，研究了高压静电场对金针菇原生质体再生的影响。结果表明，经1 000 kV/m高压静电场处理金针菇原生质体（3904×107个/ml）20 min，可提高原生质体的再生率。
关键词：高压静电场；原生质体；再生
中图分类号：S646.1+5文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0084-03
近年来，静电场的生物学效应问题越来越受到重视，国内外学者做了大量的研究。在宏观方面，很多实验结果都证明静电场对生物体，尤其对一些农作物有明显的作用效应，但剂量不同，生物效应不同。在微观方面，不少学者从不同的角度对其作用机理作了初步探讨，但多集中在蔬菜、作物等种子处理上，在食用菌上的应用研究较少[1，2]。
金针菇是我国最早进行人工栽培的食用菌之一，其肉质脆嫩、味道鲜美、营养丰富，深受人们喜爱。通过改进培养基、栽培工艺、出菇管理条件等，金针菇的产量得到提高。但随着生产规模的扩大，尤其是工厂化、周年化栽培模式的出现，对优质、高产菌种的需求越来越迫切，而传统育种手段周期长、成本高，制约着金针菇新品种的育成[3]。
20世纪60年代出现了原生质体融合技术，通过脱壁后不同遗传类型的原生质体在融合剂的诱导下融合，最终达到部分或整套基因组的交换和重组，产生新的品种和类型。与传统杂交育种相比，原生质体融合可以使远缘杂交成为可能，遗传物质亦可进行较完整的交换，且参与融合的亲本数不局限于2个。
目前应用原生质体技术进行食用菌育种已有报道：任轩等以杏鲍菇和平菇为亲本菌株，采用双亲灭活原生质体融合技术选育出高漆酶活性且遗传稳定的融合菌株[4]；李艳红等利用原生质体紫外诱变进行了猴头菌新菌种的研究[5]，但尚未见利用高压静电场对金针菇原生质进行处理的研究报道。本试验研究了高压静电场对金针菇原生质体的影响，以便为金针菇原生质体融合育种提供技术支持。
1材料与方法
11供试菌株
金白1号（本所保存）。
12培养基
液体培养基（PDL）：马铃薯200 g，MgSO4 05 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 05 g，水1 L。
原生质体再生培养基（RM ）：马铃薯 200 g，酵母膏 20 g，蛋白胨20 g，蔗糖 20 g，MgSO4 15 g，甘露醇 10932 g，琼脂20 g，水1 L，pH 50～60。
13试剂
高渗稳定剂（等渗液）：06 mol/L 甘露醇；溶壁酶（lywallzyme，广东省科学院微生物研究所）；无菌蒸馏水。
14仪器及其他用具
灭菌备用器具：1 ml、200 μl 枪头，5 ml 注射器（内塞脱脂棉），三角瓶，烧杯，滤纸，5 ml离心管。
其他：1 ml 、200 μl移液枪，接种针，涂布棒，镊子，28℃ 水浴锅，离心机，恒温培养箱，静电场发生设备，游标卡尺等。
15试验方法
151溶壁酶的配制 称取015 g溶壁酶， 加入无菌06 mol/L甘露醇10 ml，再用022 μm细菌滤膜过滤于50 ml 三角瓶中，制成15%的溶壁酶液。
152原生质体的制备将供试菌株接种于装有PDL 培养基的三角瓶中，28℃静置培养5～7 d。将培养好的液体培养物倒入离心管，用无菌水洗涤2～3次，再用06 mol/L 甘露醇洗涤2～3次， 将菌丝体上的水用无菌滤纸吸干后，分成小块，装入5 ml无菌离心管。
按250 g菌丝体需2 ml 酶液的量加入15%溶壁酶液，28℃水浴脱壁3 h，间歇30 min振荡一次。将酶裂解液倒入5 ml注射器管中（内加脱脂棉），过滤于另一干燥离心管，离心后洗涤2～3次，最后加06 mol/L的甘露醇 2～3 ml悬浮，制得原生质体原液。 用06 mol/L甘露醇将原生质体原液梯度稀释，制得原生质体10、100倍稀释液。
153原生质体的高压静电场处理及再生将原生质体原液及其10倍、100倍稀释液按高压静电场处理条件分组，分别取100 μl均匀涂布于再生平板上。
高压静电场处理：按静电场强度500、750、1 000 kV/m分3个处理组，空白对照（不处理）1组，每组3个重复，处理20 min。
原生质体再生：各处理组经高压静电处理后与对照组一起置于28℃培养箱中培养，培养至第6天统计菌落数，计算原生质体再生率。
再生率（%）=再生菌落数/原生质体数×100
2结果与分析
21原生质体镜检计数结果
对原生质体10倍稀释液进行镜检计数，结果见表1。
22不同静电场处理对金针菇原生质体再生的影响
由表2可以看出，不同处理组合对金针菇原生质体的再生率影响不同，以10倍稀释液、1 000 kV/m处理20 min效果较好，再生率可达 00124%，其它处理与对照差异不大。原生质体浓度对试验结果影响较大，以10倍稀释液（3904×107个/ml）较好，原液浓度过高计数、分离困难，100倍稀释液则浓度过低，原生质体基本不能再生。
自然界中的一切物体都处于静电场的作用之下，静电场对生物体的生命活动具有重要的影响，环境电场的变化，特别是外加的高压静电场，会对生物体的电荷分布、排列、运动发生改变，从而影响生物体的方方面面。
目前的研究认为静电场主要通过以下几方面发挥作用：一是改变酶的活性。高压静电场能够直接作用于酶，使得酶的活力和构象发生变化，合适的高压静电场能够使酶的活力增高，而过高的高压静电场能使酶的活力降低。高压静电场对酶的作用基本上是可逆的，经高压静电场处理的酶稳定性增加[6，7]。二是改变细胞膜的通透性。静电场产生的电位差能促进ATP的合成，触发酶类的活化，使细胞内外通透性增加，有利于营养物质的吸收利用，产生生物效应和增产效果[8，9]。三是影响遗传物质。一定强度的静电场能够缩短细胞有丝分裂周期，提高细胞分裂速度，产生植物细胞的多核现象，引起植物细胞的染色体畸变[10]。
本试验表明，利用1 000 kV/m高压静电场处理金针菇原生质体20 min，可提高金针菇原生质体的再生率。至于高压静电场是否影响金针菇原生质体的遗传物质，经高压静电场处理后的再生体农艺性状是否改变，还需进一步验证。
参考文献：
[1]侯福林，金兰芝，柳建军，等 高压静电场对春萝卜种子活力的影响[J]山东农业科学，1995，5：32-33
[2]熊建平，朱久运，马坚扬，等 黄瓜高压静电育种机理的研究[J]生物磁学，2004，4（4）：13-16
[3]宋冬灵，曾宪贤，吕杰，等 金针菇遗传育种研究进展 [J]种子，2007，26（5）：52-54
[4]李艳红，李莉 原生质体紫外诱变选育猴头菌新菌种的研究[J]山东农业科学，2006，2：42-43
[5]任轩，贾乐，宋振，等双亲灭活原生质体电诱导融合法选育高漆酶活性菌株[J]山东农业科学，2008，8：66-69
[6]朱诚 ，房正浓高压静电场处理对老化黄瓜种子脂质过氧化的影响[J]浙江大学学报（农业与生命科学版），2000，26（2）：127-130
[7]郭维生， 杨性愉高压静电场对α-淀粉酶构象的影响[J]内蒙古大学学报（自然科学版），2001，32（3）：349-351
[8]温尚斌， 马福荣 高压静电场促进植物吸收离子机理的初步探讨[J]生物化学与生物物理进展，1995，22（4）：377-379
[9]易伟松，谢菊芳，江厚敏，等高压静电场对离子跨膜转运的影响机理再探[J]湖北大学学报（自然科学版），2003，25（1）：46-48
[10]郭维生，杨体强高压静电场对鲱鱼DNA X射线衍射谱的影响[J]内蒙古大学学报（自然科学版），2001，32（3）：258-260
关键词：高压静电场；原生质体；再生
中图分类号：S646.1+5文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0084-03
近年来，静电场的生物学效应问题越来越受到重视，国内外学者做了大量的研究。在宏观方面，很多实验结果都证明静电场对生物体，尤其对一些农作物有明显的作用效应，但剂量不同，生物效应不同。在微观方面，不少学者从不同的角度对其作用机理作了初步探讨，但多集中在蔬菜、作物等种子处理上，在食用菌上的应用研究较少[1，2]。
金针菇是我国最早进行人工栽培的食用菌之一，其肉质脆嫩、味道鲜美、营养丰富，深受人们喜爱。通过改进培养基、栽培工艺、出菇管理条件等，金针菇的产量得到提高。但随着生产规模的扩大，尤其是工厂化、周年化栽培模式的出现，对优质、高产菌种的需求越来越迫切，而传统育种手段周期长、成本高，制约着金针菇新品种的育成[3]。
20世纪60年代出现了原生质体融合技术，通过脱壁后不同遗传类型的原生质体在融合剂的诱导下融合，最终达到部分或整套基因组的交换和重组，产生新的品种和类型。与传统杂交育种相比，原生质体融合可以使远缘杂交成为可能，遗传物质亦可进行较完整的交换，且参与融合的亲本数不局限于2个。
目前应用原生质体技术进行食用菌育种已有报道：任轩等以杏鲍菇和平菇为亲本菌株，采用双亲灭活原生质体融合技术选育出高漆酶活性且遗传稳定的融合菌株[4]；李艳红等利用原生质体紫外诱变进行了猴头菌新菌种的研究[5]，但尚未见利用高压静电场对金针菇原生质进行处理的研究报道。本试验研究了高压静电场对金针菇原生质体的影响，以便为金针菇原生质体融合育种提供技术支持。
1材料与方法
11供试菌株
金白1号（本所保存）。
12培养基
液体培养基（PDL）：马铃薯200 g，MgSO4 05 g，葡萄糖20 g，KH2PO4 05 g，水1 L。
原生质体再生培养基（RM ）：马铃薯 200 g，酵母膏 20 g，蛋白胨20 g，蔗糖 20 g，MgSO4 15 g，甘露醇 10932 g，琼脂20 g，水1 L，pH 50～60。
13试剂
高渗稳定剂（等渗液）：06 mol/L 甘露醇；溶壁酶（lywallzyme，广东省科学院微生物研究所）；无菌蒸馏水。
14仪器及其他用具
灭菌备用器具：1 ml、200 μl 枪头，5 ml 注射器（内塞脱脂棉），三角瓶，烧杯，滤纸，5 ml离心管。
其他：1 ml 、200 μl移液枪，接种针，涂布棒，镊子，28℃ 水浴锅，离心机，恒温培养箱，静电场发生设备，游标卡尺等。
15试验方法
151溶壁酶的配制 称取015 g溶壁酶， 加入无菌06 mol/L甘露醇10 ml，再用022 μm细菌滤膜过滤于50 ml 三角瓶中，制成15%的溶壁酶液。
152原生质体的制备将供试菌株接种于装有PDL 培养基的三角瓶中，28℃静置培养5～7 d。将培养好的液体培养物倒入离心管，用无菌水洗涤2～3次，再用06 mol/L 甘露醇洗涤2～3次， 将菌丝体上的水用无菌滤纸吸干后，分成小块，装入5 ml无菌离心管。
按250 g菌丝体需2 ml 酶液的量加入15%溶壁酶液，28℃水浴脱壁3 h，间歇30 min振荡一次。将酶裂解液倒入5 ml注射器管中（内加脱脂棉），过滤于另一干燥离心管，离心后洗涤2～3次，最后加06 mol/L的甘露醇 2～3 ml悬浮，制得原生质体原液。 用06 mol/L甘露醇将原生质体原液梯度稀释，制得原生质体10、100倍稀释液。
153原生质体的高压静电场处理及再生将原生质体原液及其10倍、100倍稀释液按高压静电场处理条件分组，分别取100 μl均匀涂布于再生平板上。
高压静电场处理：按静电场强度500、750、1 000 kV/m分3个处理组，空白对照（不处理）1组，每组3个重复，处理20 min。
原生质体再生：各处理组经高压静电处理后与对照组一起置于28℃培养箱中培养，培养至第6天统计菌落数，计算原生质体再生率。
再生率（%）=再生菌落数/原生质体数×100
2结果与分析
21原生质体镜检计数结果
对原生质体10倍稀释液进行镜检计数，结果见表1。
22不同静电场处理对金针菇原生质体再生的影响
由表2可以看出，不同处理组合对金针菇原生质体的再生率影响不同，以10倍稀释液、1 000 kV/m处理20 min效果较好，再生率可达 00124%，其它处理与对照差异不大。原生质体浓度对试验结果影响较大，以10倍稀释液（3904×107个/ml）较好，原液浓度过高计数、分离困难，100倍稀释液则浓度过低，原生质体基本不能再生。
自然界中的一切物体都处于静电场的作用之下，静电场对生物体的生命活动具有重要的影响，环境电场的变化，特别是外加的高压静电场，会对生物体的电荷分布、排列、运动发生改变，从而影响生物体的方方面面。
目前的研究认为静电场主要通过以下几方面发挥作用：一是改变酶的活性。高压静电场能够直接作用于酶，使得酶的活力和构象发生变化，合适的高压静电场能够使酶的活力增高，而过高的高压静电场能使酶的活力降低。高压静电场对酶的作用基本上是可逆的，经高压静电场处理的酶稳定性增加[6，7]。二是改变细胞膜的通透性。静电场产生的电位差能促进ATP的合成，触发酶类的活化，使细胞内外通透性增加，有利于营养物质的吸收利用，产生生物效应和增产效果[8，9]。三是影响遗传物质。一定强度的静电场能够缩短细胞有丝分裂周期，提高细胞分裂速度，产生植物细胞的多核现象，引起植物细胞的染色体畸变[10]。
本试验表明，利用1 000 kV/m高压静电场处理金针菇原生质体20 min，可提高金针菇原生质体的再生率。至于高压静电场是否影响金针菇原生质体的遗传物质，经高压静电场处理后的再生体农艺性状是否改变，还需进一步验证。
参考文献：
[1]侯福林，金兰芝，柳建军，等 高压静电场对春萝卜种子活力的影响[J]山东农业科学，1995，5：32-33
[2]熊建平，朱久运，马坚扬，等 黄瓜高压静电育种机理的研究[J]生物磁学，2004，4（4）：13-16
[3]宋冬灵，曾宪贤，吕杰，等 金针菇遗传育种研究进展 [J]种子，2007，26（5）：52-54
[4]李艳红，李莉 原生质体紫外诱变选育猴头菌新菌种的研究[J]山东农业科学，2006，2：42-43
[5]任轩，贾乐，宋振，等双亲灭活原生质体电诱导融合法选育高漆酶活性菌株[J]山东农业科学，2008，8：66-69
[6]朱诚 ，房正浓高压静电场处理对老化黄瓜种子脂质过氧化的影响[J]浙江大学学报（农业与生命科学版），2000，26（2）：127-130
[7]郭维生， 杨性愉高压静电场对α-淀粉酶构象的影响[J]内蒙古大学学报（自然科学版），2001，32（3）：349-351
[8]温尚斌， 马福荣 高压静电场促进植物吸收离子机理的初步探讨[J]生物化学与生物物理进展，1995，22（4）：377-379
[9]易伟松，谢菊芳，江厚敏，等高压静电场对离子跨膜转运的影响机理再探[J]湖北大学学报（自然科学版），2003，25（1）：46-48
[10]郭维生，杨体强高压静电场对鲱鱼DNA X射线衍射谱的影响[J]内蒙古大学学报（自然科学版），2001，32（3）：258-260