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摘要：利用黄淮稻区主栽品种圣稻13、圣稻15、镇稻88为受体亲本，选择以籼稻明恢63为背景的转基因抗虫材料TT51 （cry1Ab/1Ac）、T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）和以粳稻中花11为背景的转基因抗虫材料RJ- 5（cry1C）为供体，分别进行杂交和多代回交。每一世代后代单株，通过涂抹Basta抗性筛选，结合PCR鉴定跟踪抗虫目的基因以及田间抗虫性鉴定、农艺性状选择，培育出来源于TT51带有cry1Ab/1Ac基因的抗虫稳定株系3个，来源于T2A-1带有cry2A基因的稳定株系2个，来源于T1C-19带有cry1C基因的稳定株系3个，来源于RJ- 5带有cry1C基因的抗虫稳定株系2个。这些株系于田间均表现出很好的抗虫性状和优质丰产性状，为黄淮稻区抗虫转基因水稻育种奠定了基础。
关键词：抗虫转基因水稻；回交转育； Basta；PCR检测；抗虫性鉴定
中图分类号：S511.035.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0038-04
水稻是最主要的粮食作物，世界上超过一半人口以其为主食。鳞翅目害虫一直是水稻的最大威胁之一。据统计，每年由于虫害造成的损失达数亿美元[1]。
由于水稻本身尚未发现有效的抗虫基因，传统育种面临很多困难。目前，Bt毒蛋白基因是使用最广泛的基因，用转基因的方法将Bt毒蛋白基因导入常规水稻，可使水稻对螟虫的抗性提高[2]。转基因植物中的外源基因在自交T1代群体中一般遵循孟德尔分离规律，在转基因植株与常规品种的杂交后代中，也能以单显性基因方式遗传[3，4]。因此可以通过对转基因株系与主栽品种进行多次回交转育和选择，使轮回亲本基因频率逐渐增加，从而获得具有良好抗虫性和优质丰产性状的改良新品种[6，7]。
本课题组利用已获得的三个以籼稻明恢63为遗传背景的抗虫转基因株系和一个以粳稻中花11为背景的抗虫转基因材料分别与黄淮稻区主栽品种圣稻13、圣稻15、镇稻88进行杂交和回交，利用抗虫基因cry2A和cry1C与Bar基因紧密连锁的关系[5]，对其杂交和回交后代进行了Basta涂抹筛选，结合PCR鉴定跟踪抗虫目的基因、田间抗虫鉴定、农艺性状选择，育出了农艺性状优良的抗虫转基因水稻新品系。
1材料与方法
11亲本材料
以华中农业大学提供的单拷贝转Bt基因水稻株系 TT51 （cry1Ab/1Ac）、T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）、RJ-5（cry1C）为父本，以黄淮稻区主栽品种圣稻13、圣稻15、镇稻88为母本分别进行杂交与回交，获得F1、BC1F1、 BC2F1、BC3F1、BC3F2等世代。
12杂交及回交转育
在8月中下旬，选取正处于开花期的稻穗，以黄淮稻区主栽品种为母本，46℃温水去雄，以转Bt基因水稻株系为父本分别进行杂交获得F1代，再以黄淮稻区主栽品种为轮回亲本，连续回交获得BC1F1、BC2F1、BC3F1等世代以及自交后代BC3F2。在开花前对每一个杂交或回交后代单株均进行除草剂Basta抗性检测和PCR分子检测跟踪抗虫基因，结合田间筛选，从中选择与亲本外观形状相似的转基因阳性植株再与轮回亲本连续回交，或自交纯合。
13Basta抗性选择
待转基因水稻长至20 cm左右时，进行除草剂Basta（有效成分PPT）抗性检测，PPT浓度为1 g/L，用棉签双面浸蘸然后涂在植株的叶片上，3～5 d后统计抗性株数及敏感株数。
14PCR分子检测
选取Basta检测阳性植株，摘取幼嫩叶片，充分研磨，利用TPS法[8]提取DNA，备用。根据三个抗虫基因序列设计三对特异PCR引物，25 μl反应体系，94℃预热5 min，35个循环（94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min），72℃延伸5 min[9]。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离和EB染色后在紫外透射仪下观察。
15转基因植株的田间抗虫鉴定
在不用任何药剂防治螟虫的情况下，于螟虫高发期田间调查稻纵卷叶螟危害情况及其引起的白穗发生情况，统计白穗率。
16田间种植及农艺性状考察
在济南饮马泉试验农场种植转基因水稻，小区面积为667 m2，重复2次，同时种植主栽品种圣稻13、圣稻15、镇稻88为对照。田间管理同大田，但不施用任何农药防虫防病。考察的农艺性状有生育期、株高、穗长、穗粒数、千粒重和产量等。
2结果与分析
21转育经过
2009年配制杂交组合TT51 （cry1Ab/1Ac）/圣稻13、TT51 （cry1Ab/1Ac）/圣稻15、TT51 （cry1Ab/1Ac）/镇稻88、T2A-1（cry2A）/圣稻13、T2A-1（cry2A）/圣稻15、T2A-1（cry2A）/镇稻88、T1C-19（cry1C）/圣稻13、T1C-19（cry1C）/圣稻15、T1C-19（cry1C）/镇稻88、RJ-5（cry1C）/圣稻13、RJ-5（cry1C）/圣稻15、RJ-5（cry1C）/镇稻88。2010年分别以圣稻13、圣稻15、镇稻88为轮回亲本进行回交，获得BC1F1，同年海南南繁获得BC2F1，2011年获得BC3F1，2012年自交获得BC3F2。
22Bt转基因植株除草剂抗性鉴定
对杂交和回交后代单株进行除草剂Basta抗性鉴定。PPT浓度为1 g/L[10]，单面涂抹叶片，3～4 d调查，结果显示：转Bt基因且带有Bar基因标记的T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）、RJ-5（cry1C）株系与黄淮海主栽品种圣稻13、圣稻15、镇稻88的杂交后代F1分离群体中Basta的阴阳性分离比例按照1∶1分离，由此表明三个外源基因均为单显性基因且遵循孟德尔分离规律。 23Bt转基因植株的PCR检测
由于TT51 （cry1Ab/1Ac） 转基因株系无Bar基因标记，所以需对所有以TT51 （cry1Ab/1Ac）转基因株系为父本的杂交和回交后代单株进行PCR分子检测跟踪Bt基因，对其他三个转基因株系为父本的杂交及回交后代选取Basta检测为阳性的转基因株系进行PCR分子检测，选取阳性植株。检测显示Basta检测阳性的植株PCR分子检测均为阳性，表明了Bar基因和目的基因cry2A和cry1C是协同表达的。部分阳性植株PCR检测结果见图1、图2、图3。
24Bt转基因植株的田间抗虫性鉴定
田间种植观察TT51 （cry1Ab/1Ac）、T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）及RJ-5（cry1C）转基因株系与黄淮稻区主栽品种圣稻13、圣稻15、镇稻88分别杂交的后代F1和回交世代BC1F1、BC2F1、BC3F1及BC3F2代材料。插秧时分单株插栽，涂抹Basta 5 d后根据Basta抗性表现，挂牌标记阴阳性植株，见图4。田间自插秧到收获未施任何农药。在稻纵卷叶螟大发生时期，转基因水稻几乎没有受到卷叶螟的危害，而对照和非转基因水稻卷叶螟危害严重，黄淮稻区品种圣稻13、圣稻15和镇稻88白穗率（死亡率）达到50%，而转基因水稻新品系白穗率相当低，小于01%，如图5。田间调查白穗率发生情况，结果如表1。
25回交和自交后代的田间农艺性状和产量表现
回交转育的目的是为育出转基因水稻新品系，所以在对抗性选育的同时，更注重了对产量、品质等综合性状的选育。对获得的3个源于TT51带有cry1Ab/1Ac基因的抗虫稳定株系，2个来源于T2A-1带有cry2A基因的稳定株系，3个来源于T1C-19带有cry1C基因的稳定株系，2个来源于RJ-5带有cry1C基因的抗虫稳定株系，2012年在济南饮马泉试验农场按小区种植，每小区面积为667 m2，同时种植主栽品种圣稻13、圣稻15和镇稻88 为对照。田间管理同大田，但不施用任何农药防虫防病。考察的农艺性状有生育期、株高、穗长、穗粒数、千粒重和产量等。通过回交转育培育出的转基因水稻新品系主要农艺性状田间表现如表2所示。
3结论与讨论
转基因水稻成功运用取决于外源基因在植物体中能否保持遗传的稳定性[11，12]。在水稻抗虫育种方面，国内外相继有不少获得抗虫转基因植株的报道[13，14]。但由于转化过程中诸多因素的影响，有些水稻品种很难转化或转化率很低[15，16]；有些虽获得部分转基因植株，但因转基因植株农艺性状不佳，难以直接应用于农业生产[17，18]。本研究将现代生物技术与传统育种方法相结合，采用杂交、回交等方法将抗虫基因转入栽培品种中，为充分利用已获得的抗性转基因材料提供了广阔的前景。本研究结果显示，cry1Ab/1Ac、cry2A、cry1C基因及其介导的抗性在所有回交获得的转基因株系中均能稳定遗传和表达，回交转基因株系同样表现出很强的抗虫能力。利用回交转育技术，已获得多个优质、高产且抗性稳定的水稻新品系。本试验中由于粳稻和籼稻品种杂交其后代的抽穗期很晚，不易收获，故采用遮光处理方法并有效解决了抽穗期晚的问题。参考文献：
[1] Heinrichs E A， Medrano F G， Rapusas H R Genetic evaluation for insect resistance in rice[R] International Rice Reseach Institute， Los Banos， Philippines， 1985
[2]Oard J H， Linscombe S D， Braverman M P， et al Development， field evaluation， and agronomic performance of transgenic herbicide resistant rice[J] Molecular Breeding， 1996， 2：359-368
[3]Baker B， Zambryski P， Staskawicz B， et al Signaling in plant-microbe interactions[J] Crop Sci， 1997， 276：726-733
[4]Koizumi S Rice blast control with multilines in Japan[A]In：Mew T W， Borrmeo E， Hardy B Exploiting biodiversity for sustainable pest management[R] Manila： International Rice Reseach Institue，2001，143-157
[5]Chen H，Tang W，Xu C GTransgenic indica rice plants harboring a synthetic cry2A* gene of Bacillus thuringiensis exhibit enhanced resistance against Iepidopteran rice pests[J] Theor Appl Genet，2005，111：1330-1337
[6]陈浩，林拥军，张启发 转基因水稻研究的回顾与展望[J] 科学通报，2009， 54（18）：2699-2717
[7]易自立，王紫萱，覃静萍，等 转溶酶菌酶基因水稻回交转育籼型杂交稻亲本[J] 中国水稻科学，2006，20（2）：147-152
[8]朱常香，姚方印，温孚江，等 Cry1A（b）基因及其介导的抗性在转基因水稻中的遗传[J]植物保护学报，2003， 30（1）：1-6
[9]姚方印，朱常香，刘理梅，等 提高水稻成熟种胚愈伤组织诱导率及再生率的研究[J] 山东农业科学，2000，4：7-9
[10]姚方印，李广贤，杨磊，等 农杆菌介导将白叶枯病抗性基因Xa21导入水稻获得转基因植株[J] 西北植物学报，2002，22（5）：1038-1043
[11]郭宁，张玉江，江昌俊转bar基因小麦的回交转育研究[J] 安徽农业大学学报，2007，34（2）：218-221
[12]朱常香，胡全安，温孚江， 等用两个抗虫基因分别转化水稻及抗虫株系的获得[J] 农业生物技术学报，1999，3（3）：259-266
[13]慈晓燕，姚方印，朱常香， 等 含Cry1Ab和Xa2基因抗病虫水稻选育研究及其田间表现[J] 中国农业科学，2005，38（2）：313-319
[14]姚方印，朱常香，李光贤， 等 Bt水稻的抗虫性鉴定及转基因的遗传分析[J] 中国农业科学，2002，35（2）：142-145
[15]王忠华，舒庆尧，崔海瑞，等 Bt转基因水稻“克螟稻”杂交后代二化螟抗性研究初报[J] 作物学报，2000，26（3）：310-314
[16]华志华，朱雪峰，吴明国，等 水稻转基因整合模式中外源基因的遗传规律[J] 作物学报，2003，29（1）：44-48
[17]吴家道，杨剑波，许传万，等 水稻抗白叶枯病基因Xa21转基因水稻及其杂交稻研究[J] 作物学报，2001，27（1）：29-34
[18]王中华，成雄鹰 Bt水稻杂交育种中转基因的遗传分析[J] 遗传，2000， 22（5）：309-312
关键词：抗虫转基因水稻；回交转育； Basta；PCR检测；抗虫性鉴定
中图分类号：S511.035.3文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0038-04
水稻是最主要的粮食作物，世界上超过一半人口以其为主食。鳞翅目害虫一直是水稻的最大威胁之一。据统计，每年由于虫害造成的损失达数亿美元[1]。
由于水稻本身尚未发现有效的抗虫基因，传统育种面临很多困难。目前，Bt毒蛋白基因是使用最广泛的基因，用转基因的方法将Bt毒蛋白基因导入常规水稻，可使水稻对螟虫的抗性提高[2]。转基因植物中的外源基因在自交T1代群体中一般遵循孟德尔分离规律，在转基因植株与常规品种的杂交后代中，也能以单显性基因方式遗传[3，4]。因此可以通过对转基因株系与主栽品种进行多次回交转育和选择，使轮回亲本基因频率逐渐增加，从而获得具有良好抗虫性和优质丰产性状的改良新品种[6，7]。
本课题组利用已获得的三个以籼稻明恢63为遗传背景的抗虫转基因株系和一个以粳稻中花11为背景的抗虫转基因材料分别与黄淮稻区主栽品种圣稻13、圣稻15、镇稻88进行杂交和回交，利用抗虫基因cry2A和cry1C与Bar基因紧密连锁的关系[5]，对其杂交和回交后代进行了Basta涂抹筛选，结合PCR鉴定跟踪抗虫目的基因、田间抗虫鉴定、农艺性状选择，育出了农艺性状优良的抗虫转基因水稻新品系。
1材料与方法
11亲本材料
以华中农业大学提供的单拷贝转Bt基因水稻株系 TT51 （cry1Ab/1Ac）、T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）、RJ-5（cry1C）为父本，以黄淮稻区主栽品种圣稻13、圣稻15、镇稻88为母本分别进行杂交与回交，获得F1、BC1F1、 BC2F1、BC3F1、BC3F2等世代。
12杂交及回交转育
在8月中下旬，选取正处于开花期的稻穗，以黄淮稻区主栽品种为母本，46℃温水去雄，以转Bt基因水稻株系为父本分别进行杂交获得F1代，再以黄淮稻区主栽品种为轮回亲本，连续回交获得BC1F1、BC2F1、BC3F1等世代以及自交后代BC3F2。在开花前对每一个杂交或回交后代单株均进行除草剂Basta抗性检测和PCR分子检测跟踪抗虫基因，结合田间筛选，从中选择与亲本外观形状相似的转基因阳性植株再与轮回亲本连续回交，或自交纯合。
13Basta抗性选择
待转基因水稻长至20 cm左右时，进行除草剂Basta（有效成分PPT）抗性检测，PPT浓度为1 g/L，用棉签双面浸蘸然后涂在植株的叶片上，3～5 d后统计抗性株数及敏感株数。
14PCR分子检测
选取Basta检测阳性植株，摘取幼嫩叶片，充分研磨，利用TPS法[8]提取DNA，备用。根据三个抗虫基因序列设计三对特异PCR引物，25 μl反应体系，94℃预热5 min，35个循环（94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min），72℃延伸5 min[9]。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离和EB染色后在紫外透射仪下观察。
15转基因植株的田间抗虫鉴定
在不用任何药剂防治螟虫的情况下，于螟虫高发期田间调查稻纵卷叶螟危害情况及其引起的白穗发生情况，统计白穗率。
16田间种植及农艺性状考察
在济南饮马泉试验农场种植转基因水稻，小区面积为667 m2，重复2次，同时种植主栽品种圣稻13、圣稻15、镇稻88为对照。田间管理同大田，但不施用任何农药防虫防病。考察的农艺性状有生育期、株高、穗长、穗粒数、千粒重和产量等。
2结果与分析
21转育经过
2009年配制杂交组合TT51 （cry1Ab/1Ac）/圣稻13、TT51 （cry1Ab/1Ac）/圣稻15、TT51 （cry1Ab/1Ac）/镇稻88、T2A-1（cry2A）/圣稻13、T2A-1（cry2A）/圣稻15、T2A-1（cry2A）/镇稻88、T1C-19（cry1C）/圣稻13、T1C-19（cry1C）/圣稻15、T1C-19（cry1C）/镇稻88、RJ-5（cry1C）/圣稻13、RJ-5（cry1C）/圣稻15、RJ-5（cry1C）/镇稻88。2010年分别以圣稻13、圣稻15、镇稻88为轮回亲本进行回交，获得BC1F1，同年海南南繁获得BC2F1，2011年获得BC3F1，2012年自交获得BC3F2。
22Bt转基因植株除草剂抗性鉴定
对杂交和回交后代单株进行除草剂Basta抗性鉴定。PPT浓度为1 g/L[10]，单面涂抹叶片，3～4 d调查，结果显示：转Bt基因且带有Bar基因标记的T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）、RJ-5（cry1C）株系与黄淮海主栽品种圣稻13、圣稻15、镇稻88的杂交后代F1分离群体中Basta的阴阳性分离比例按照1∶1分离，由此表明三个外源基因均为单显性基因且遵循孟德尔分离规律。 23Bt转基因植株的PCR检测
由于TT51 （cry1Ab/1Ac） 转基因株系无Bar基因标记，所以需对所有以TT51 （cry1Ab/1Ac）转基因株系为父本的杂交和回交后代单株进行PCR分子检测跟踪Bt基因，对其他三个转基因株系为父本的杂交及回交后代选取Basta检测为阳性的转基因株系进行PCR分子检测，选取阳性植株。检测显示Basta检测阳性的植株PCR分子检测均为阳性，表明了Bar基因和目的基因cry2A和cry1C是协同表达的。部分阳性植株PCR检测结果见图1、图2、图3。
24Bt转基因植株的田间抗虫性鉴定
田间种植观察TT51 （cry1Ab/1Ac）、T2A-1（cry2A）、T1C-19（cry1C）及RJ-5（cry1C）转基因株系与黄淮稻区主栽品种圣稻13、圣稻15、镇稻88分别杂交的后代F1和回交世代BC1F1、BC2F1、BC3F1及BC3F2代材料。插秧时分单株插栽，涂抹Basta 5 d后根据Basta抗性表现，挂牌标记阴阳性植株，见图4。田间自插秧到收获未施任何农药。在稻纵卷叶螟大发生时期，转基因水稻几乎没有受到卷叶螟的危害，而对照和非转基因水稻卷叶螟危害严重，黄淮稻区品种圣稻13、圣稻15和镇稻88白穗率（死亡率）达到50%，而转基因水稻新品系白穗率相当低，小于01%，如图5。田间调查白穗率发生情况，结果如表1。
25回交和自交后代的田间农艺性状和产量表现
回交转育的目的是为育出转基因水稻新品系，所以在对抗性选育的同时，更注重了对产量、品质等综合性状的选育。对获得的3个源于TT51带有cry1Ab/1Ac基因的抗虫稳定株系，2个来源于T2A-1带有cry2A基因的稳定株系，3个来源于T1C-19带有cry1C基因的稳定株系，2个来源于RJ-5带有cry1C基因的抗虫稳定株系，2012年在济南饮马泉试验农场按小区种植，每小区面积为667 m2，同时种植主栽品种圣稻13、圣稻15和镇稻88 为对照。田间管理同大田，但不施用任何农药防虫防病。考察的农艺性状有生育期、株高、穗长、穗粒数、千粒重和产量等。通过回交转育培育出的转基因水稻新品系主要农艺性状田间表现如表2所示。
3结论与讨论
转基因水稻成功运用取决于外源基因在植物体中能否保持遗传的稳定性[11，12]。在水稻抗虫育种方面，国内外相继有不少获得抗虫转基因植株的报道[13，14]。但由于转化过程中诸多因素的影响，有些水稻品种很难转化或转化率很低[15，16]；有些虽获得部分转基因植株，但因转基因植株农艺性状不佳，难以直接应用于农业生产[17，18]。本研究将现代生物技术与传统育种方法相结合，采用杂交、回交等方法将抗虫基因转入栽培品种中，为充分利用已获得的抗性转基因材料提供了广阔的前景。本研究结果显示，cry1Ab/1Ac、cry2A、cry1C基因及其介导的抗性在所有回交获得的转基因株系中均能稳定遗传和表达，回交转基因株系同样表现出很强的抗虫能力。利用回交转育技术，已获得多个优质、高产且抗性稳定的水稻新品系。本试验中由于粳稻和籼稻品种杂交其后代的抽穗期很晚，不易收获，故采用遮光处理方法并有效解决了抽穗期晚的问题。参考文献：
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[14]姚方印，朱常香，李光贤， 等 Bt水稻的抗虫性鉴定及转基因的遗传分析[J] 中国农业科学，2002，35（2）：142-145
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[16]华志华，朱雪峰，吴明国，等 水稻转基因整合模式中外源基因的遗传规律[J] 作物学报，2003，29（1）：44-48
[17]吴家道，杨剑波，许传万，等 水稻抗白叶枯病基因Xa21转基因水稻及其杂交稻研究[J] 作物学报，2001，27（1）：29-34
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