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摘要：以小麦山融3号为试验材料，克隆了TaLTR cDNA序列（Low temperature-responsive RNA-binding protein）。序列分析表明，TaLTR序列包含完整的ORF区，编码蛋白含有162个氨基酸，其氨基端包含一个RRM（RNA recognition domain）超家族保守的结构域，羧基端则富含甘氨酸；经半定量RT-PCR分析，表明TaLTR参与低温、干旱、盐胁迫逆境反应。
关键词：小麦；TaLTR基因；RT-PCR；逆境胁迫
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0025-05
小麦是约35%世界人口的主要粮食，其种植面积约占谷类作物种植总面积的三分之一。低温、干旱是影响小麦生产的主要非生物胁迫因子，研究小麦对干旱、低温等胁迫的响应机制，发掘逆境应答相关蛋白基因，对于研究小麦抗逆分子机制及增强抗逆性具有重要的理论和实践意义。
非生物逆境胁迫下，涉及离子转运与平衡、细胞生长和分裂、细胞防御和解毒、能量产生与运输以及渗透调节等生理代谢的大量基因的表达都会发生变化[1]。为此，山东大学夏光敏实验室利用SSH、基因芯片及双向电泳-质谱分析等方法，对耐盐抗旱小麦新品种山融3号盐或干旱胁迫前后的表达谱进行了分析，获得了大量表达模式发生变化的基因或ESTs信息[2～4]。本研究从山融3号盐胁迫前后的表达谱芯片结果中选取1个表达变化的EST（EST ID：WL403），对其进行了基因克隆、初步表达分析。
1材料与方法
11实验材料
111材料小麦（Triticum aestivum L）品种山融3号，由山东大学夏光敏实验室提供；菌株：大肠杆菌（Escherichia coil） DH5α（北京全式金生物技术有限公司）。
112试剂Trizol为Invitrogen公司产品；常用内切酶、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit为Fermentas公司产品；Taq酶使用宝生物工程（大连）有限公司产品Mighty Amp DNA Polymerase （hot start）；pEASY-T3载体为北京全式金生物技术有限公司产品。
12方法
121总RNA提取和cDNA合成Trizol法提取各取样时间点的小麦总RNA。根据Fermentas的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit使用说明，反转录合成小麦cDNA的第一条链。
122TaLTR基因的全长cDNA克隆分析小麦基因芯片和双向电泳结果，筛选小麦EST数据库，从对应ESTs中选择克隆一个盐胁迫下表达发生变化的基因。根据EST文库中拼接高度同源的ESTs序列，设计特异性引物TaLOW-S1/A1，扩增获得153 bp的小片段（TaLOW-S1：5′-TTAGGGTTTAGTAGTAGCGGGG-3′；TaLOW -A1：5′-GTCAGTGATGATCTTGGAGTCG-3′），经5′-和3′-RACE扩增，拼接后获得556 bp cDNA序列。利用ORF finder 程序（http：//wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml）预测拼接序列的开放阅读框（ORF）。
使用Primer Premier 50 软件在预测的开放阅读框两侧设计特异引物TaLTR-F1/R1，得到一对能有效扩增TaLTR的引物（TaLTR-F1：5′-GAATGGCGGACGTCGAGT-3′；TaLTR -R1：5′-ATCGGGTAACTAGGATAACTGG-3′），以反转录的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，测序。
PCR程序为：98℃ 5 min；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，32循环；72℃ 10 min；16℃保存。
123TaLTR序列分析利用网站资源对TaLTR基因进行序列分析。NCBI进行nBLAST同源性比对；使用http：//auexpasyorg/ tools/dnahtml翻译TaLTR氨基酸序列；以InterPro Scan为工具分析蛋白质序列的结构域；运用MEGA31软件构建TaLTR基因编码蛋白的同源系统进化树；运用DNAMAN、clustalX软件构建多重序列比对图谱。
124基于半定量RT-PCR的初步表达分析挑选生长至两叶一心、健壮的山融3号小麦进行如下胁迫处理：200 mmol/L NaCl泡根处理72 h，然后恢复72 h；18% PEG 6000浸根处理72 h，随后恢复72 h；对照为正常条件下同期生长的健康植株。分别在0、05、1、2、6、12、24、48、72 h恢复48 h和恢复72 h取样，液氮冷冻后-70℃保存备用。
取山融3号小麦植株胁迫处理不同时间点的根和叶，Trizol法提取RNA并进行反转录。以反转录的cDNA第一链为模板，以TaActin-S（5′-AGCCATACCGTGCCAATC-3′）和TaActin-A（5′-AGAGCCTCCAATCCAGAC-3′）作为扩增引物，获得558 bp左右的Actin内参产物片段。以TaLTR-S1、TaLTR-A1作为扩增引物，获得153 bp左右目的基因产物。Actin基因PCR程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30循环；72℃ 10 min；4℃保存。以Actin基因获得的cDNA模板量和循环次数、最佳扩增程序获得单一的TaLTR目的产物带。PCR条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30循环；72℃ 10 min；4℃保存。 2结果与分析
21TaLTR基因的cDNA克隆
根据小麦EST WL403序列在NCBI中搜索与其同源的小麦ESTs序列，共获得321条序列。将这321条序列和5′-、3′-RACE扩增序列进行拼接获得1个长度为689 bp的contig。进一步设计特异性引物TaLTR-F1和TaLTR-R1扩增包括完整ORF的cDNA序列，得到约556 bp的产物（图1），命名为TaLTR（GI：Kc408381）。回收目标扩增产物克隆到pEASY-T3载体中，对重组质粒进行酶切验证（图2）和序列测定，测序结果及推导的氨基酸序列见图3。
22TaLTR基因的序列分析和同源性比较
对获得的556 bp cDNA序列初步分析表明，该序列包含完整的ORF区，预测编码的蛋白含有162个氨基酸。运用ExPasy、InterPro网站进行蛋白质结构域和功能位点预测，结果显示，TaLTR基因编码的蛋白氨基端包含一个RRM（RNA recognition motif domain）超家族保守的结构域，羧基端则富含甘氨酸（图4）。
将TaLTR基因推导预测的氨基酸序列在NCBI上作BLAST比较，结果显示，其RRM结构域氨基酸与小麦TaGRP2、大麦GRP HORVU、水稻OsGRP1、玉米grp1、拟南芥AtGRP7的RRM结构域氨基酸序列一致性分别为99%、99%、79%、81%、81%，说明该结构域具有较强的保守性（图5）。运用MEGA31软件构建了TaLTR基因编码的蛋白与其他物种同源蛋白的系统进化树，结果表明，来源于单子叶植物的蛋白序列与双子叶植物的同源蛋白明显分为两支，而在单子叶植物这一支上TaLTR与小麦TaGRP2、大麦GRP HORVU聚在一起（图6）。
迄今为止，尚未见对小麦TaGRP2和大麦GRP HORVU基因功能研究的报道。对拟南芥同源基因AtGRP7基因功能的研究发现，AtGRP7是冷胁迫过程中的一个RNA伴侣因子，其N-端的RRM结构域在冷胁迫适应过程中起关键作用[5]。研究还发现，AtGRP7基因通过抑制开花抑制子FLC的表达控制植物由营养生长到生殖生长的转换[6]。不同物种的TaLTR同源蛋白的RRM结构域具有极高的保守性，预示它们在功能上可能也具有某些相似性。小麦TaLTR基因是否具有拟南芥AtGRP7基因同样的功能还有待进一步实验验证。
23基于半定量RT-PCR的TaLTR基因在干旱、盐和低温胁迫下的初步表达分析
无论在根中还是在叶中，干旱、高盐和低温胁迫都可诱导TaLTR基因的表达量增加。18% PEG6000和200 mmol/L NaCl诱导的TaLTR基因表达在受胁迫6～12 h达到峰值，之后会逐渐下降恢复到正常水平（图7A、7B和7D、7E）；而该基因的表达在4℃低温处理05 h到72 h持续升高，恢复到室温后基因表达量也相应恢复到原有水平（（图7C和7F）。上述结果表明，TaLTR基因可以应答干旱和高盐的胁迫，但其表达增强时间很短，有可能是一种应激反应的结果；而在小麦适应冷胁迫过程中，该基因无论根中还是叶中表达量持续升高，推测它在应答低温胁迫中起更重要作用。结合序列同源性分析的结果，初步推测，TaLTR基因在小麦冷胁迫适应过程中，可能与小麦花期转换、调控春化作用相关基因的表达密切相关。
3结论
本研究克隆了小麦山融3号TaLTR基因，通过对其进行序列分析以及RT-PCR半定量初步表达分析，推测TaLTR基因可能在应对低温胁迫时起到重要作用。该基因同时还受到高盐和干旱胁迫的诱导表达。TaLTR基因具体行使哪些功能，是否可调控春化相关基因表达进而影响植物开花时间，需要进一步的实验验证。这些问题的解决或许将有助于揭示作物低温应答机制，为研究小麦抗逆生理机制以及抗逆育种提供基础材料。
参考文献：
[1]单雷， 赵双宜， 夏光敏 植物耐盐相关基因及其耐盐机制研究进展 [J]分子植物育种， 2006， 4（1）： 15-22
[2]Peng Z Y， Wang M C， Li F， et al A proteomic study of the response to salinity and drought stress in an introgression strain of bread wheat [J] Mol Cell Proteomics， 2009， 8（12）： 2676-2686
[3]Liu C， Li S， Wang M C， et al A transcriptomic analysis reveals the nature of salinity tolerance of a wheat introgression line [J] Plant Mol Biol， 2012， 78（1-2）： 159-169
[4]Wang M C， Peng Z Y， Li C L， et al Proteomic analysis on a high salt tolerance introgression strain of Triricum aestivum/Thinopyrum ponticum [J] Proteomics， 2008， 8（7）： 1470-1489
[5]Kwak K J， Park S J， Han J H， et al Structural determinants crucial to the RNA chaperone activity of glycine-rich RNA-binding proteins 4 and 7 in Arabidopsis thaliana during the cold adaptation process [J] Journal of Experimental Botany， 2011， 62（11）： 4003–4011
[6]Streitner C， Danisman S， Wehrle F， et alThe small glycine-rich RNA bingding protein AtGRP7 promotes florals transition in Arabidopsis thaliana [J] Plant J， 2008， 56（2）： 239-250
关键词：小麦；TaLTR基因；RT-PCR；逆境胁迫
中图分类号：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2013）01-0025-05
小麦是约35%世界人口的主要粮食，其种植面积约占谷类作物种植总面积的三分之一。低温、干旱是影响小麦生产的主要非生物胁迫因子，研究小麦对干旱、低温等胁迫的响应机制，发掘逆境应答相关蛋白基因，对于研究小麦抗逆分子机制及增强抗逆性具有重要的理论和实践意义。
非生物逆境胁迫下，涉及离子转运与平衡、细胞生长和分裂、细胞防御和解毒、能量产生与运输以及渗透调节等生理代谢的大量基因的表达都会发生变化[1]。为此，山东大学夏光敏实验室利用SSH、基因芯片及双向电泳-质谱分析等方法，对耐盐抗旱小麦新品种山融3号盐或干旱胁迫前后的表达谱进行了分析，获得了大量表达模式发生变化的基因或ESTs信息[2～4]。本研究从山融3号盐胁迫前后的表达谱芯片结果中选取1个表达变化的EST（EST ID：WL403），对其进行了基因克隆、初步表达分析。
1材料与方法
11实验材料
111材料小麦（Triticum aestivum L）品种山融3号，由山东大学夏光敏实验室提供；菌株：大肠杆菌（Escherichia coil） DH5α（北京全式金生物技术有限公司）。
112试剂Trizol为Invitrogen公司产品；常用内切酶、RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit为Fermentas公司产品；Taq酶使用宝生物工程（大连）有限公司产品Mighty Amp DNA Polymerase （hot start）；pEASY-T3载体为北京全式金生物技术有限公司产品。
12方法
121总RNA提取和cDNA合成Trizol法提取各取样时间点的小麦总RNA。根据Fermentas的RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit使用说明，反转录合成小麦cDNA的第一条链。
122TaLTR基因的全长cDNA克隆分析小麦基因芯片和双向电泳结果，筛选小麦EST数据库，从对应ESTs中选择克隆一个盐胁迫下表达发生变化的基因。根据EST文库中拼接高度同源的ESTs序列，设计特异性引物TaLOW-S1/A1，扩增获得153 bp的小片段（TaLOW-S1：5′-TTAGGGTTTAGTAGTAGCGGGG-3′；TaLOW -A1：5′-GTCAGTGATGATCTTGGAGTCG-3′），经5′-和3′-RACE扩增，拼接后获得556 bp cDNA序列。利用ORF finder 程序（http：//wwwncbinlmnihgov/gorf/gorfhtml）预测拼接序列的开放阅读框（ORF）。
使用Primer Premier 50 软件在预测的开放阅读框两侧设计特异引物TaLTR-F1/R1，得到一对能有效扩增TaLTR的引物（TaLTR-F1：5′-GAATGGCGGACGTCGAGT-3′；TaLTR -R1：5′-ATCGGGTAACTAGGATAACTGG-3′），以反转录的cDNA第一链为模板，进行PCR扩增，测序。
PCR程序为：98℃ 5 min；98℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 45 s，32循环；72℃ 10 min；16℃保存。
123TaLTR序列分析利用网站资源对TaLTR基因进行序列分析。NCBI进行nBLAST同源性比对；使用http：//auexpasyorg/ tools/dnahtml翻译TaLTR氨基酸序列；以InterPro Scan为工具分析蛋白质序列的结构域；运用MEGA31软件构建TaLTR基因编码蛋白的同源系统进化树；运用DNAMAN、clustalX软件构建多重序列比对图谱。
124基于半定量RT-PCR的初步表达分析挑选生长至两叶一心、健壮的山融3号小麦进行如下胁迫处理：200 mmol/L NaCl泡根处理72 h，然后恢复72 h；18% PEG 6000浸根处理72 h，随后恢复72 h；对照为正常条件下同期生长的健康植株。分别在0、05、1、2、6、12、24、48、72 h恢复48 h和恢复72 h取样，液氮冷冻后-70℃保存备用。
取山融3号小麦植株胁迫处理不同时间点的根和叶，Trizol法提取RNA并进行反转录。以反转录的cDNA第一链为模板，以TaActin-S（5′-AGCCATACCGTGCCAATC-3′）和TaActin-A（5′-AGAGCCTCCAATCCAGAC-3′）作为扩增引物，获得558 bp左右的Actin内参产物片段。以TaLTR-S1、TaLTR-A1作为扩增引物，获得153 bp左右目的基因产物。Actin基因PCR程序为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30循环；72℃ 10 min；4℃保存。以Actin基因获得的cDNA模板量和循环次数、最佳扩增程序获得单一的TaLTR目的产物带。PCR条件为：94℃ 5 min；94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 30 s，30循环；72℃ 10 min；4℃保存。 2结果与分析
21TaLTR基因的cDNA克隆
根据小麦EST WL403序列在NCBI中搜索与其同源的小麦ESTs序列，共获得321条序列。将这321条序列和5′-、3′-RACE扩增序列进行拼接获得1个长度为689 bp的contig。进一步设计特异性引物TaLTR-F1和TaLTR-R1扩增包括完整ORF的cDNA序列，得到约556 bp的产物（图1），命名为TaLTR（GI：Kc408381）。回收目标扩增产物克隆到pEASY-T3载体中，对重组质粒进行酶切验证（图2）和序列测定，测序结果及推导的氨基酸序列见图3。
22TaLTR基因的序列分析和同源性比较
对获得的556 bp cDNA序列初步分析表明，该序列包含完整的ORF区，预测编码的蛋白含有162个氨基酸。运用ExPasy、InterPro网站进行蛋白质结构域和功能位点预测，结果显示，TaLTR基因编码的蛋白氨基端包含一个RRM（RNA recognition motif domain）超家族保守的结构域，羧基端则富含甘氨酸（图4）。
将TaLTR基因推导预测的氨基酸序列在NCBI上作BLAST比较，结果显示，其RRM结构域氨基酸与小麦TaGRP2、大麦GRP HORVU、水稻OsGRP1、玉米grp1、拟南芥AtGRP7的RRM结构域氨基酸序列一致性分别为99%、99%、79%、81%、81%，说明该结构域具有较强的保守性（图5）。运用MEGA31软件构建了TaLTR基因编码的蛋白与其他物种同源蛋白的系统进化树，结果表明，来源于单子叶植物的蛋白序列与双子叶植物的同源蛋白明显分为两支，而在单子叶植物这一支上TaLTR与小麦TaGRP2、大麦GRP HORVU聚在一起（图6）。
迄今为止，尚未见对小麦TaGRP2和大麦GRP HORVU基因功能研究的报道。对拟南芥同源基因AtGRP7基因功能的研究发现，AtGRP7是冷胁迫过程中的一个RNA伴侣因子，其N-端的RRM结构域在冷胁迫适应过程中起关键作用[5]。研究还发现，AtGRP7基因通过抑制开花抑制子FLC的表达控制植物由营养生长到生殖生长的转换[6]。不同物种的TaLTR同源蛋白的RRM结构域具有极高的保守性，预示它们在功能上可能也具有某些相似性。小麦TaLTR基因是否具有拟南芥AtGRP7基因同样的功能还有待进一步实验验证。
23基于半定量RT-PCR的TaLTR基因在干旱、盐和低温胁迫下的初步表达分析
无论在根中还是在叶中，干旱、高盐和低温胁迫都可诱导TaLTR基因的表达量增加。18% PEG6000和200 mmol/L NaCl诱导的TaLTR基因表达在受胁迫6～12 h达到峰值，之后会逐渐下降恢复到正常水平（图7A、7B和7D、7E）；而该基因的表达在4℃低温处理05 h到72 h持续升高，恢复到室温后基因表达量也相应恢复到原有水平（（图7C和7F）。上述结果表明，TaLTR基因可以应答干旱和高盐的胁迫，但其表达增强时间很短，有可能是一种应激反应的结果；而在小麦适应冷胁迫过程中，该基因无论根中还是叶中表达量持续升高，推测它在应答低温胁迫中起更重要作用。结合序列同源性分析的结果，初步推测，TaLTR基因在小麦冷胁迫适应过程中，可能与小麦花期转换、调控春化作用相关基因的表达密切相关。
3结论
本研究克隆了小麦山融3号TaLTR基因，通过对其进行序列分析以及RT-PCR半定量初步表达分析，推测TaLTR基因可能在应对低温胁迫时起到重要作用。该基因同时还受到高盐和干旱胁迫的诱导表达。TaLTR基因具体行使哪些功能，是否可调控春化相关基因表达进而影响植物开花时间，需要进一步的实验验证。这些问题的解决或许将有助于揭示作物低温应答机制，为研究小麦抗逆生理机制以及抗逆育种提供基础材料。
参考文献：
[1]单雷， 赵双宜， 夏光敏 植物耐盐相关基因及其耐盐机制研究进展 [J]分子植物育种， 2006， 4（1）： 15-22
[2]Peng Z Y， Wang M C， Li F， et al A proteomic study of the response to salinity and drought stress in an introgression strain of bread wheat [J] Mol Cell Proteomics， 2009， 8（12）： 2676-2686
[3]Liu C， Li S， Wang M C， et al A transcriptomic analysis reveals the nature of salinity tolerance of a wheat introgression line [J] Plant Mol Biol， 2012， 78（1-2）： 159-169
[4]Wang M C， Peng Z Y， Li C L， et al Proteomic analysis on a high salt tolerance introgression strain of Triricum aestivum/Thinopyrum ponticum [J] Proteomics， 2008， 8（7）： 1470-1489
[5]Kwak K J， Park S J， Han J H， et al Structural determinants crucial to the RNA chaperone activity of glycine-rich RNA-binding proteins 4 and 7 in Arabidopsis thaliana during the cold adaptation process [J] Journal of Experimental Botany， 2011， 62（11）： 4003–4011
[6]Streitner C， Danisman S， Wehrle F， et alThe small glycine-rich RNA bingding protein AtGRP7 promotes florals transition in Arabidopsis thaliana [J] Plant J， 2008， 56（2）： 239-250