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目前，有关脂肪源性干细胞（Adipose—derived stem cells，ADSC）的分离和提取主要以Zuk等提出的方法为蓝本（见表1），进行改进形成各自使用的实验步骤。由于实验室分离、提取多用于基础研究，当中获取细胞的过程多数未能顾及临床应用时所考虑的问题，如：传播动物源性疾病的风险、生产的时间、治疗的成本等。然而，转化医学“From Bench to Bedside”的目标就是将实验室研究的成果应用于临床创造新的疗法。在此之前，必须透彻地分析每个处理细胞的步骤是否会对人体存有潜在的危害，用起来是否经济、是否简便易于操作等，以便新的疗法能够服务于大众的医疗需求。本文综合动物及人体来源提取脂肪源性干细胞
（Adipose-derived stem cells，ADSC）的过程，从ADSC分离、提取、扩增三方面进行剖析，以期为临床转化应用提供参考。
1 脂肪源性基质血管组分（SiromaJ vascularfraction，SVF）的分离步骤存在的问题
从脂肪组织分离SVF，使用的酶种类及其浓度的关系还没有完整的研究报道。可以用于消化脂肪组织的酶有胶原酶、分散酶、透明质酸酶等，以胶原酶最为广泛使用，使用的浓度有0.01%、0.075%、0.05%，尚未有统一。陶凯等为了了解不同胶原酶浓度、胶原酶消化时间和血清浓度对于人脂肪来源干细胞体外培养的不同效果，采用0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml四种不同胶原酶浓度进行消化，最后结果是在消化1h时，2.0mg/ml组消化细胞总数最多，提示消化过程中有浓度依赖性。陈超等曾评价不同的细胞对不同酶的耐受性不同，因此，必须把握酶消化的酶浓度与消化时间，提高分离细胞的纯度与存活率。如：观察组织块已经分散而失去块的形状，形成细胞一酶混合液，可以认为已消化充分。如果消化时间过长，培养瓶中的组织块就会变成细胞碎片。
酶消化法的另一缺点就是存在细胞毒性，一般的消化酶有可能包含内毒素、其他的蛋白酶、异种蛋白。针对此问题，目前研究了几种非酶性的细胞分离法，如：荧光激活细胞分选法（Fluorescence—activated cell sorting，FACS）、使用涂有特异性抗体的免疫磁珠筛选法（Immunomagnetic-bead purification）、乙醛脱氢酶的选择表达法等。这些方法虽然避免了消化酶的细胞毒性问题，却带来了过高的研究成本，不便于临床大量使用。因此，现有的分离法，除了要考虑是否符合GMP/GCP指南的要求，还需要更多实用的应用实验使之在实践中逐步完善。
2 正确提取ADSC在转化医学的意义
迄今为止，研究报告指出影响ADSC提取的因素大致可分为六个方面：脂肪老化程度，脂肪细胞的活性随着患者的年龄下降，能提取ADSC的量相对减少；对吸脂部位，人体不同部位囤积的脂肪含量有别，较容易囤积脂肪的地方，如：腹部、大腿均能有效提取所需的ADSC：脂肪提取组织的粉碎程度，不同的抽脂方法会影响脂肪组织的粉碎程度，脂肪组织越细，胶原酶才能更有效消化脂肪组织并提取更多ADSC；浓度离心速度，研究表示高速离心会降低ADSC活性，但最理想的离心速度到目前为止并没有确切的方案：SVF的净度，抽脂后大量血细胞及纤维组织粘附在脂肪表面，虽然没有临床证据证明这些组织会妨碍ADSC成长，但属贴壁性生长的ADSC在体外实验中显示大量倍增需要纯净的环境；细胞存储方法，不同的降温速度及冷冻试剂都对ADSC的活性有影响，要减低对ADSC的损害并将之发展为医疗产业，必须积极研究有效获取ADSC的方法。
以上因素当中跟转化医学关系最为密切的，就是SVF的净度。从脂肪组织分离SVF后，一般实验室会使用生理盐水（PBS）或红细胞裂解液冲洗SVF，将多余的红细胞去除免得其妨碍ADSC的贴壁生长，从而提高所提的ADSC的纯度。Horn等的研究示，使用含氯化铵的红细胞裂解液相比单核细胞密度分离更快捷提取间充质干细胞
（mesenchymal stemcells，MSC）。报告指出，经离心法初步分离出来的MSC混合了不同类型的基质细胞，要找出方便、有效独立提取ADS的方法才能减少增殖时间，迅速达到适合临床应用的细胞量。
使用氯化铵裂解液的唯一缺点就是氯化铵具细胞毒性，所以通过其提取的ADSC有可能存在违背临床转化应用的主旨。虽然说明氯化铵对人体有何直接影响的临床报道并不多，但曾经有研究指出经过氯化铵裂解后提取的ADSC存活力不高，因此，许多针对临床研究的实验室都直接放弃裂解的部分。针对红细胞裂解液在临床使用的安全性的研究并不多，碍于氯化铵的毒性始终对人体细胞有潜在的安全威胁，对ADSC的存活力可能潜在的不良影响，要兼顾ADSC的提取效率，必须另觅有效且安全性较高的红细胞裂解液。
最近，于春艳等的研究提出氯化铵对人体内的自噬一溶酶体系统的活动有不良影响。当体内出现内源性物质，包括细胞内由于生理或病理原因而被损伤的细胞器，或过量储存的糖元等，它们可被细胞自身的膜（如内质网或高尔基复合体的膜）包裹形成自噬体（autophgosome），形成内源性物质囊泡。而自噬体与初级溶酶体接触后，两者将融合形成自噬溶酶体。该实验显示，透射电镜观察可见在含氯化铵的环境下，自噬体与溶酶体并没有完全融合，因此增加维生素K3诱导的细胞凋亡，同时伴有caspase非依赖细胞死亡途径，确认了氯化铵的细胞毒性，以及可能诱发对人体有害的机制。另外，巩文玉等研究也报道含氯化氨的红细胞裂解液影响细胞的表面抗原蛋白的表示，尤其使CD34不能正常表达，影响细胞计数，暗示氯化铵的细胞毒性或许影响基因排序，导致蛋白反应异常。既然以上研究提出了氯化铵对细胞损害的证据，因此提取ADSC的方案必须顾及使用临床认可并能安全体内吸收的溶液与试剂，如：氯化钠溶液。另外，除了研究红细胞裂解的新方法，还应该积极探索其他提高ADSC纯净度的方法，如：多次冲洗或应用简单的渗透原理减少多余的红细胞。 3 体外培养ADSC主要面对的安全问题
3.1 动物源性疾病传播的风险：胎牛血清（FoetalBovine Serum，FBS）被广泛使用于ADSC扩增与分化的步骤中，但这种方法在理论上存在传播动物源性传染病（bovine spongiform encephalopathy，BSE）及导致血清病的风险。虽然研究表示新生牛血清跟胎牛血清培养基均对ADSC的质量与产量有正面影响，但是FBS蛋白跟ADSC蛋白有可能在培养基中结合，到临床使用时有机会传播病毒或病毒性疾病、诱发异种免疫反应，甚至即时排斥的免疫反应，对患者的生命存在威胁。鉴于此类问题的存在，有研究报道提出使用人的血清或血小板源性产品作为培养基的可能性，目的是把细胞产品人源化以稳定细胞产品的活力，同时杜绝动物源性疾病传播的风险。
除此以外，科学家们正积极研究可否采用无血清的培养方法。无血清培养基（serum freemedium，SFM）顾名思义不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的合成培养基。由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子，如：纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞以悬浮形式生长。SFM不但可避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，还可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性，有利于体外培养细胞的分化；缺点主要是成本高，以及悬浮细胞易受某些机械因素和化学因素的影响。
3.2 低温储存ADSC的潜在风险：液氮深低温保存对ADSC扩增及分化能力没有明显影响。不过，有关如何最大限度保存ADSC的生物特性则有赖于合适的冷冻保护剂和对应的培养基。Martinello等在犬ADSC低温赋存研究中证实长期保存（1年）并不影响ASCs的MSC特性，但会使ADSC的增殖率和端粒酶的活性降低；类似的结果也在大鼠及人ADSC中发现。为加快ADSC的临床应用，必须有效长期保存ADSC能够以供患者日后不时之需。常规冷冻法，又名逐步冷冻法，进行冷冻前需要在培养基中置入不同的冷冻保护剂，如：二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），不仅有细胞毒性，还能以时间依赖的方式诱导细胞走向凋亡（apoptosis）；解冻时则需要置入含血清的PBS彻底脱除冷冻保护剂，引申上述的动物源性疾病问题。不少研究比较不同的冷冻保护剂，也提出过新的保护剂取代DMSO，如：聚乙烯吡咯烷（polyvinylpyrrolidon，PVP），CELLBANKER2，但最近Miyamoto等表示最可行的保存ADSC的办法，是在培养基中加入丝胶蛋白（sericin），因其含有丰富丝氨酸，在脂肪和脂肪酸的新陈代谢中发挥重要作用，解冻后的ADSC存活率高达95%。另外，也有研究使用开放式拉长塑料细管法保存ADSC。可是其存量少，即使细胞复原率相对较高，不适宜大规模应用。而且，开放式暗示细胞接触液氮的机会率高，很容易造成污染，对日后使用者产生威胁。
上述方法虽然能应对目前ADSC的需求，可是要大量储存以应对未来再生医学的发展，必须更进一步研究低成本又方便存取的储存方法，确保ADSC有稳定性高的复原率和存活率，才能使患者受益。
3.3 缺乏标准化的实验程序：细胞的生产程序必须确保细胞产品的重复性和可靠性，才能投入量化生产并使之应用普及。目前绝大多数实验室使用几个常规的步骤处理脂肪组织来源的细胞。这些步骤包括：PBS冲洗、酶消化或机械破碎脂肪组织、离心以便分离出可供直接使用或低温贮藏的SVF，或者培养扩增以产生ASCs。虽然有关如何提取ADSC的理论越来越成熟，但是现有的研究必须考虑其出处是否符合药品生产质量管理规范（Good ManufacturePraetices，GMP），以及药物临床试验管理规范（Good clinic Practices，GMP）实践指南的要求。GMP/GCP要求严格登记细胞生产过程中的操作步骤，而且所使用的设备必须有合资格的认证，符合这两个条件的研究成果的可信度和实际应用能力较高，相对临床参考价值也更大。
目前，ADSC在人体的临床应用还处于早期阶段，缺乏循证医学的证据。因此，实行大规模的临床实验前，有必要在早期的临床研究中，有计划地开展随机双盲对照实验，为最终的循证医学分析积累资料。这需要多中心研究单位共同协调与规划，将有关ADSC的动物研究数据转移到人体，找出ADSC于人体的相关指标，才能保证ADSC的安全应用，并有望普及以ADSC为基础的细胞疗法。
4 小结
虽然目前的技术都可以大规模扩增ADSC并保持其生物特性，但是临床转化应用ADSC必须尽最大可能避免潜在的危险性，防止诱发其他疾病或损害。实行患者利益导向政策，确保没有产生后遗症或副作用的操作工序，寻找快捷且低成本的方法获取ADSC，使细胞治疗能够普遍应用，最终惠及民生。根据转化医学的原则，要把基础研究成果转化为可在临床实际应用的产品，除了必须准确地判断和预该产品的安全性及有效性，还需要在重复生产时达到一定的稳定性，才能将创新的科研成果用作医疗手段。为此，需要全球各实验室通力合作，制定一个规范的程序使其分离、提取、培养、储存中每一个步骤都标准化以便监管，逐渐使ADSC的生产标准化，避免研发投入与支出失衡。要将ADSC应用于临床治疗，ADSC应该符合以下四个条件：①可以于异体安全及有效地使用，减低患者负担；②遵从国际认可规程分离、提取、扩增ADSC使质量得到控制和保证；③大规模体外生产制造ADSC的实践指南降低成本；④允许调控ADSC分化的方向及进程并重复培养结果。
（Adipose-derived stem cells，ADSC）的过程，从ADSC分离、提取、扩增三方面进行剖析，以期为临床转化应用提供参考。
1 脂肪源性基质血管组分（SiromaJ vascularfraction，SVF）的分离步骤存在的问题
从脂肪组织分离SVF，使用的酶种类及其浓度的关系还没有完整的研究报道。可以用于消化脂肪组织的酶有胶原酶、分散酶、透明质酸酶等，以胶原酶最为广泛使用，使用的浓度有0.01%、0.075%、0.05%，尚未有统一。陶凯等为了了解不同胶原酶浓度、胶原酶消化时间和血清浓度对于人脂肪来源干细胞体外培养的不同效果，采用0.5、1.0、1.5、2.0mg/ml四种不同胶原酶浓度进行消化，最后结果是在消化1h时，2.0mg/ml组消化细胞总数最多，提示消化过程中有浓度依赖性。陈超等曾评价不同的细胞对不同酶的耐受性不同，因此，必须把握酶消化的酶浓度与消化时间，提高分离细胞的纯度与存活率。如：观察组织块已经分散而失去块的形状，形成细胞一酶混合液，可以认为已消化充分。如果消化时间过长，培养瓶中的组织块就会变成细胞碎片。
酶消化法的另一缺点就是存在细胞毒性，一般的消化酶有可能包含内毒素、其他的蛋白酶、异种蛋白。针对此问题，目前研究了几种非酶性的细胞分离法，如：荧光激活细胞分选法（Fluorescence—activated cell sorting，FACS）、使用涂有特异性抗体的免疫磁珠筛选法（Immunomagnetic-bead purification）、乙醛脱氢酶的选择表达法等。这些方法虽然避免了消化酶的细胞毒性问题，却带来了过高的研究成本，不便于临床大量使用。因此，现有的分离法，除了要考虑是否符合GMP/GCP指南的要求，还需要更多实用的应用实验使之在实践中逐步完善。
2 正确提取ADSC在转化医学的意义
迄今为止，研究报告指出影响ADSC提取的因素大致可分为六个方面：脂肪老化程度，脂肪细胞的活性随着患者的年龄下降，能提取ADSC的量相对减少；对吸脂部位，人体不同部位囤积的脂肪含量有别，较容易囤积脂肪的地方，如：腹部、大腿均能有效提取所需的ADSC：脂肪提取组织的粉碎程度，不同的抽脂方法会影响脂肪组织的粉碎程度，脂肪组织越细，胶原酶才能更有效消化脂肪组织并提取更多ADSC；浓度离心速度，研究表示高速离心会降低ADSC活性，但最理想的离心速度到目前为止并没有确切的方案：SVF的净度，抽脂后大量血细胞及纤维组织粘附在脂肪表面，虽然没有临床证据证明这些组织会妨碍ADSC成长，但属贴壁性生长的ADSC在体外实验中显示大量倍增需要纯净的环境；细胞存储方法，不同的降温速度及冷冻试剂都对ADSC的活性有影响，要减低对ADSC的损害并将之发展为医疗产业，必须积极研究有效获取ADSC的方法。
以上因素当中跟转化医学关系最为密切的，就是SVF的净度。从脂肪组织分离SVF后，一般实验室会使用生理盐水（PBS）或红细胞裂解液冲洗SVF，将多余的红细胞去除免得其妨碍ADSC的贴壁生长，从而提高所提的ADSC的纯度。Horn等的研究示，使用含氯化铵的红细胞裂解液相比单核细胞密度分离更快捷提取间充质干细胞
（mesenchymal stemcells，MSC）。报告指出，经离心法初步分离出来的MSC混合了不同类型的基质细胞，要找出方便、有效独立提取ADS的方法才能减少增殖时间，迅速达到适合临床应用的细胞量。
使用氯化铵裂解液的唯一缺点就是氯化铵具细胞毒性，所以通过其提取的ADSC有可能存在违背临床转化应用的主旨。虽然说明氯化铵对人体有何直接影响的临床报道并不多，但曾经有研究指出经过氯化铵裂解后提取的ADSC存活力不高，因此，许多针对临床研究的实验室都直接放弃裂解的部分。针对红细胞裂解液在临床使用的安全性的研究并不多，碍于氯化铵的毒性始终对人体细胞有潜在的安全威胁，对ADSC的存活力可能潜在的不良影响，要兼顾ADSC的提取效率，必须另觅有效且安全性较高的红细胞裂解液。
最近，于春艳等的研究提出氯化铵对人体内的自噬一溶酶体系统的活动有不良影响。当体内出现内源性物质，包括细胞内由于生理或病理原因而被损伤的细胞器，或过量储存的糖元等，它们可被细胞自身的膜（如内质网或高尔基复合体的膜）包裹形成自噬体（autophgosome），形成内源性物质囊泡。而自噬体与初级溶酶体接触后，两者将融合形成自噬溶酶体。该实验显示，透射电镜观察可见在含氯化铵的环境下，自噬体与溶酶体并没有完全融合，因此增加维生素K3诱导的细胞凋亡，同时伴有caspase非依赖细胞死亡途径，确认了氯化铵的细胞毒性，以及可能诱发对人体有害的机制。另外，巩文玉等研究也报道含氯化氨的红细胞裂解液影响细胞的表面抗原蛋白的表示，尤其使CD34不能正常表达，影响细胞计数，暗示氯化铵的细胞毒性或许影响基因排序，导致蛋白反应异常。既然以上研究提出了氯化铵对细胞损害的证据，因此提取ADSC的方案必须顾及使用临床认可并能安全体内吸收的溶液与试剂，如：氯化钠溶液。另外，除了研究红细胞裂解的新方法，还应该积极探索其他提高ADSC纯净度的方法，如：多次冲洗或应用简单的渗透原理减少多余的红细胞。 3 体外培养ADSC主要面对的安全问题
3.1 动物源性疾病传播的风险：胎牛血清（FoetalBovine Serum，FBS）被广泛使用于ADSC扩增与分化的步骤中，但这种方法在理论上存在传播动物源性传染病（bovine spongiform encephalopathy，BSE）及导致血清病的风险。虽然研究表示新生牛血清跟胎牛血清培养基均对ADSC的质量与产量有正面影响，但是FBS蛋白跟ADSC蛋白有可能在培养基中结合，到临床使用时有机会传播病毒或病毒性疾病、诱发异种免疫反应，甚至即时排斥的免疫反应，对患者的生命存在威胁。鉴于此类问题的存在，有研究报道提出使用人的血清或血小板源性产品作为培养基的可能性，目的是把细胞产品人源化以稳定细胞产品的活力，同时杜绝动物源性疾病传播的风险。
除此以外，科学家们正积极研究可否采用无血清的培养方法。无血清培养基（serum freemedium，SFM）顾名思义不需要添加血清就可以维持细胞在体外较长时间生长、繁殖的合成培养基。由于缺乏血清中的各种粘附贴壁因子，如：纤粘连蛋白、层粘连蛋白、胶原、玻表粘连蛋白，细胞以悬浮形式生长。SFM不但可避免血清对细胞的毒性作用和血清源性污染，还可避免血清批次间的质量变动，提高细胞培养和实验结果的重复性，有利于体外培养细胞的分化；缺点主要是成本高，以及悬浮细胞易受某些机械因素和化学因素的影响。
3.2 低温储存ADSC的潜在风险：液氮深低温保存对ADSC扩增及分化能力没有明显影响。不过，有关如何最大限度保存ADSC的生物特性则有赖于合适的冷冻保护剂和对应的培养基。Martinello等在犬ADSC低温赋存研究中证实长期保存（1年）并不影响ASCs的MSC特性，但会使ADSC的增殖率和端粒酶的活性降低；类似的结果也在大鼠及人ADSC中发现。为加快ADSC的临床应用，必须有效长期保存ADSC能够以供患者日后不时之需。常规冷冻法，又名逐步冷冻法，进行冷冻前需要在培养基中置入不同的冷冻保护剂，如：二甲亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），不仅有细胞毒性，还能以时间依赖的方式诱导细胞走向凋亡（apoptosis）；解冻时则需要置入含血清的PBS彻底脱除冷冻保护剂，引申上述的动物源性疾病问题。不少研究比较不同的冷冻保护剂，也提出过新的保护剂取代DMSO，如：聚乙烯吡咯烷（polyvinylpyrrolidon，PVP），CELLBANKER2，但最近Miyamoto等表示最可行的保存ADSC的办法，是在培养基中加入丝胶蛋白（sericin），因其含有丰富丝氨酸，在脂肪和脂肪酸的新陈代谢中发挥重要作用，解冻后的ADSC存活率高达95%。另外，也有研究使用开放式拉长塑料细管法保存ADSC。可是其存量少，即使细胞复原率相对较高，不适宜大规模应用。而且，开放式暗示细胞接触液氮的机会率高，很容易造成污染，对日后使用者产生威胁。
上述方法虽然能应对目前ADSC的需求，可是要大量储存以应对未来再生医学的发展，必须更进一步研究低成本又方便存取的储存方法，确保ADSC有稳定性高的复原率和存活率，才能使患者受益。
3.3 缺乏标准化的实验程序：细胞的生产程序必须确保细胞产品的重复性和可靠性，才能投入量化生产并使之应用普及。目前绝大多数实验室使用几个常规的步骤处理脂肪组织来源的细胞。这些步骤包括：PBS冲洗、酶消化或机械破碎脂肪组织、离心以便分离出可供直接使用或低温贮藏的SVF，或者培养扩增以产生ASCs。虽然有关如何提取ADSC的理论越来越成熟，但是现有的研究必须考虑其出处是否符合药品生产质量管理规范（Good ManufacturePraetices，GMP），以及药物临床试验管理规范（Good clinic Practices，GMP）实践指南的要求。GMP/GCP要求严格登记细胞生产过程中的操作步骤，而且所使用的设备必须有合资格的认证，符合这两个条件的研究成果的可信度和实际应用能力较高，相对临床参考价值也更大。
目前，ADSC在人体的临床应用还处于早期阶段，缺乏循证医学的证据。因此，实行大规模的临床实验前，有必要在早期的临床研究中，有计划地开展随机双盲对照实验，为最终的循证医学分析积累资料。这需要多中心研究单位共同协调与规划，将有关ADSC的动物研究数据转移到人体，找出ADSC于人体的相关指标，才能保证ADSC的安全应用，并有望普及以ADSC为基础的细胞疗法。
4 小结
虽然目前的技术都可以大规模扩增ADSC并保持其生物特性，但是临床转化应用ADSC必须尽最大可能避免潜在的危险性，防止诱发其他疾病或损害。实行患者利益导向政策，确保没有产生后遗症或副作用的操作工序，寻找快捷且低成本的方法获取ADSC，使细胞治疗能够普遍应用，最终惠及民生。根据转化医学的原则，要把基础研究成果转化为可在临床实际应用的产品，除了必须准确地判断和预该产品的安全性及有效性，还需要在重复生产时达到一定的稳定性，才能将创新的科研成果用作医疗手段。为此，需要全球各实验室通力合作，制定一个规范的程序使其分离、提取、培养、储存中每一个步骤都标准化以便监管，逐渐使ADSC的生产标准化，避免研发投入与支出失衡。要将ADSC应用于临床治疗，ADSC应该符合以下四个条件：①可以于异体安全及有效地使用，减低患者负担；②遵从国际认可规程分离、提取、扩增ADSC使质量得到控制和保证；③大规模体外生产制造ADSC的实践指南降低成本；④允许调控ADSC分化的方向及进程并重复培养结果。