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摘要：目的：建立一种快速检测降钙素原的胶体金免疫层析试纸条，并优化制备中各关键步骤的实验条件。
方法：以柠檬酸三钠还原法制备25nm的胶体金溶液，制备免疫胶体金复合物，组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条。
结果：用柠檬酸还原法制备的25nm胶体金溶液呈亮红色。胶体金标记降钙素原单克隆抗体的最低稳定浓度10μg/ml，最适稳定量为12μg/ml。降钙素原单克隆抗体标记的最适pH为7.0。应用定量检测试剂（胶体金法）和半定量检测试剂（免疫色谱检测法）对160例临床标本进行检测，通过比较阳性一致性、阴性一致性、总一致性，计算Kappa值，判断检测结果的一致性。
结论：通过对160例临床标本检测结果进行比较，阳性一致性为96.6%，阴性一致性为97.2%，总一致性为96.9%，Kappa值为0.937。胶体金免疫层析试纸条质量稳定性不但与抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等因素密切相关，而且缓冲系统的优化、辅助添加剂的选择与优化组合也非常重要。
关键词：降钙素原 胶体金 免疫层析检测
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）10-0021-02
降钙素原（Procalcitonin，PCT）是降钙素的前体激素，正常情况下由甲状腺C细胞分泌，经细胞内蛋白水解酶水解后形成的活性成分许多学者研究发现，严重全身性细菌真菌和寄生虫感染时，PCT异位生成，水平异常升高，且升高的程度与感染严重度及预后相关许多临床研究证明，PCT在不同医学领域对诊断和指导治疗有很高的价值，与目前所应用的诊断指标相比，PCT在鉴别诊断和控制感染及严重炎症方面提供了额外的信息随着临床实践性研究的不断深入，临床数据的不断积累，PCT作为一个全身性细菌感染和脓毒症辅助和鉴别诊断的常规指标将成为共识，并将得到广泛的应用[1]。
胶体金免疫层析试纸条法因其快速、简便，不需要大型装备，可以实现现场快速检测等特点，已成为目前传染病快速检测的研究热点。本研究利用双抗体夹心法制备了检测降钙素原的胶体金免疫层析试纸条，将检测结果与德国B.R.A.H.M.S GmbH公司商品化的降钙素原测定试剂盒比较，对试纸条特异性进行评价。
1 材料与方法
1.1 材料。氯金酸（HAuCl4·H2O），上海化学试剂公司产品；柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O），北京北化精细化学品有限公司产品；牛血清白蛋白（BSA），均为Sigma公司产品；聚乙二醇（PEG 20000），FLUKA公司产品；以上试剂均为分析纯。
1.2 方法。
1.2.1 玻璃器皿的清洁。制备胶体金的所用容器均应反复清洗，并硅化处理玻璃容器的内表面，最后用超纯水冲洗晾干备用。
1.2.2 胶体金颗粒的制备。采用柠檬酸三钠还原法，制备25nm的胶体金。具体操作方法如下：取100mL双蒸水，加热至沸腾加入1mL 1%的氯金酸，搅拌下准确加入1.5mL体积分数为1%的新鲜制备的柠檬酸三钠水溶液。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，20min后停止加热。冷却至室温后4℃避光保存。
1.2.3 胶体金溶液的最佳PH值确定。取1mL的胶体金溶液8份，分别用0.2mol/L K2CO3将pH值调至5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；分别加入0.2μg/mL降钙素原单克隆抗体100μL，混匀，静置10min后，加入100μL质量分数为10%为NaCl溶液，静置0.5h后观察胶体金颜色。胶体金颜色没有发生改变的最低pH值为胶体金溶液的最佳pH值。
1.2.4 确定最低蛋白稳定量。在标记前，应首先测定能稳定一定量胶体金所需要的最小蛋白用量。将胶体金溶液调至最佳PH值，抗原经高速离心除去大的聚集物，用5mmol/L PH8.0的PB溶液稀释至0.2mg/ml，将待标记降钙素原单克隆抗体逐级稀释后，各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，混匀；5min后，在上述各管内分别加入10%氯化钠溶液0.1ml，混匀，室温静置，用分光光度计OD580测定。
未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色不变。以此使胶体金红色不变而蛋白质含量最低的试管的蛋白量，即为稳定1ml胶体金的必需蛋白量，也即最低稳定量。在此基础上再加20%即为稳定1ml胶体金所需蛋白质的实际最适用量。
1.2.5 胶体金标记抗PCT单克隆抗体。
1.2.6 胶体金标记降钙素原单克隆抗体。将胶体金调至最适PH值，加入最低蛋白稳定量的抗PCT单克隆抗体。静置5min后加入过量BSA封闭，离心，用0.01mol/LTris溶液重悬，低速离心去除聚集物，上清液即为胶体金标记的抗体。
1.2.7 免疫层析试纸条的制备。免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸收垫4个部分组成。样品垫和结合垫用玻璃纤维，吸收垫用吸水滤纸。以浓度为1.38mg/mL的羊抗鼠多克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控带；以浓度为0.9mg/mL的鼠抗降钙素原单克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线作为检测带，参数0.1μL/mm划线，指控带与检测带间距约为7mm。划线后，将硝酸纤维素膜置于37℃培养箱中孵育2h。将吸收垫、样品垫及结合垫、硝酸纤维素膜叠加，组装成完整的层析条，然后切割层析条，宽度4mm/条，干燥避光保存。
1.2.8 检测及结果判读。在制备好的层析条的样品垫上手工加样100μL，15min后，检测带和指控带都出现红色为阳性，只有指控带出现红色为阴性，检测带和指控带均不显色，则为试剂失效，需换新的试纸条重测。 1.2.9 临床标本检测。用试纸条对160份进行检测，将检测结果与德国B.R.A.H.M.S GmbH公司商品化的降钙素原测定试剂盒比较，对试纸条特异性进行评价。
2 结果
2.1 最适标记胶体金PH值的确定。结果表明胶体金颜色未改变的最低pH值为7.0，因此胶体金标记降钙素原单克隆抗体的最适PH为7.0。
2.2 最低蛋白稳定量结果。分光光度计测定结果，以OD值为纵坐标，抗体用量为横坐标做一曲线，见图1。取曲线与横轴接近那一点的蛋白用量即为最小蛋白质稳定量，在此基础上再加20%即为稳定胶体金蛋白质实际用量，即选择12μg/mL的降钙素原单克隆抗体加入量作为实际最小蛋白标记量较为合适。
2.3 临床标本检测结果。胶体金试纸条与对比试剂对入选样本采用同步盲法进行检测，试验结束后进行比对，比较的结果采用2×2表统计，计算测量的一致性。
3 讨论
降钙素原（procalcitonin，PCT）是降钙素的前体，是由116个氨基酸组成、相对分子质量为127000的糖蛋白。PCT由神经内分泌细胞（包括甲状腺、肺和胰腺组织细胞）表达，经酶切分解为降钙素（CT）、羧基端肽和氨基端肽。PCT在人体内的半衰期为20～24h，稳定性好，在正常人血清中含量极低[2]。
胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于体外诊断制剂领域。在透射电镜下观察，理想的金颗粒是大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。拍片放大后测量金颗粒直径，符合制备要求。小颗粒胶体金基本是圆球形，30～80nm金颗粒则多为偏心圆形[3]。如果金颗粒大小不等或有椭圆形、三角形金颗粒存在应重新制备，造成这种情况的主要原因一般与在加还原剂时没有迅速一次性加入以及搅拌不均匀有关；此外制备量的多少、容器的大小、加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小。制备好的胶体金可因电解质、温度、金溶液的浓度变化而有不稳定和聚沉。因此，制备后最好在20天以内进行标记，室温或4℃保存，避免低温冻存[4]。
胶体金颗粒与蛋白质的结合一般通过静电感应、蛋白质疏水作用吸附于金颗粒表面，或通过蛋白质中半胱氨酸的硫残基与金颗粒的电子层发生配位结合。无论其作用机制为何，环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，一般只有在蛋白质等电点略偏碱的条件下二者才能牢固地结合。标记好的免疫胶体金纯化处理的目的是除去其中未标记的蛋白质、未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。根据胶体金颗粒大小不同和所标记蛋白质的特性不同，选择并调整离心转速和离心时间可以达到一般的纯化目的[5]。
胶体金免疫层析试纸条的研制不仅在抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等方面至关重要，而且缓冲系统的优化也必不可少。为确保试剂盒的稳定性，试纸条的组装须在洁净干燥的环境下进行，空气湿度<30%为宜。本试验制备的检测降钙素原的胶体金免疫层析试纸条经临床血清标本检测，检测结果与B.R.A.H.M.S GmbH公司商品化的降钙素原测定试剂盒比较，阳性符合率为96.6%，阴性符合率为97.2%，总符合率为96.9%，Kappa值为0.937。两种方法在灵敏度、特异性有较好的一致性。
参考文献
[1] 王蓉，陈雪雯，李桂珍.降钙素原的临床应用与研究进展[J].中国城乡企业卫生，2011，145：39-41
[2] Meisner M. Pathobiochemistry and clinical use of procalcitonin[J].Clin Chim Acta，2002，323（1-2）：17-29
[3] Bassab C，Syamal R.Manufacturing high-quality gold sol.IVD Technology，2001，8：46-54
[4] Hayat MA.Colloidal gold-principles，methods and applications.San Diego：Academic Press，1989，2-10
[5] Hermanson GT.Bioconjugate techniques.Academic Press，1996，593-602
方法：以柠檬酸三钠还原法制备25nm的胶体金溶液，制备免疫胶体金复合物，组装胶体金免疫层析快速诊断试纸条。
结果：用柠檬酸还原法制备的25nm胶体金溶液呈亮红色。胶体金标记降钙素原单克隆抗体的最低稳定浓度10μg/ml，最适稳定量为12μg/ml。降钙素原单克隆抗体标记的最适pH为7.0。应用定量检测试剂（胶体金法）和半定量检测试剂（免疫色谱检测法）对160例临床标本进行检测，通过比较阳性一致性、阴性一致性、总一致性，计算Kappa值，判断检测结果的一致性。
结论：通过对160例临床标本检测结果进行比较，阳性一致性为96.6%，阴性一致性为97.2%，总一致性为96.9%，Kappa值为0.937。胶体金免疫层析试纸条质量稳定性不但与抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等因素密切相关，而且缓冲系统的优化、辅助添加剂的选择与优化组合也非常重要。
关键词：降钙素原 胶体金 免疫层析检测
【中图分类号】R4 【文献标识码】A 【文章编号】1671-8801（2013）10-0021-02
降钙素原（Procalcitonin，PCT）是降钙素的前体激素，正常情况下由甲状腺C细胞分泌，经细胞内蛋白水解酶水解后形成的活性成分许多学者研究发现，严重全身性细菌真菌和寄生虫感染时，PCT异位生成，水平异常升高，且升高的程度与感染严重度及预后相关许多临床研究证明，PCT在不同医学领域对诊断和指导治疗有很高的价值，与目前所应用的诊断指标相比，PCT在鉴别诊断和控制感染及严重炎症方面提供了额外的信息随着临床实践性研究的不断深入，临床数据的不断积累，PCT作为一个全身性细菌感染和脓毒症辅助和鉴别诊断的常规指标将成为共识，并将得到广泛的应用[1]。
胶体金免疫层析试纸条法因其快速、简便，不需要大型装备，可以实现现场快速检测等特点，已成为目前传染病快速检测的研究热点。本研究利用双抗体夹心法制备了检测降钙素原的胶体金免疫层析试纸条，将检测结果与德国B.R.A.H.M.S GmbH公司商品化的降钙素原测定试剂盒比较，对试纸条特异性进行评价。
1 材料与方法
1.1 材料。氯金酸（HAuCl4·H2O），上海化学试剂公司产品；柠檬酸三钠（Na3C6H5O7·2H2O），北京北化精细化学品有限公司产品；牛血清白蛋白（BSA），均为Sigma公司产品；聚乙二醇（PEG 20000），FLUKA公司产品；以上试剂均为分析纯。
1.2 方法。
1.2.1 玻璃器皿的清洁。制备胶体金的所用容器均应反复清洗，并硅化处理玻璃容器的内表面，最后用超纯水冲洗晾干备用。
1.2.2 胶体金颗粒的制备。采用柠檬酸三钠还原法，制备25nm的胶体金。具体操作方法如下：取100mL双蒸水，加热至沸腾加入1mL 1%的氯金酸，搅拌下准确加入1.5mL体积分数为1%的新鲜制备的柠檬酸三钠水溶液。此时可观察到淡黄色的氯金酸水溶液在柠檬酸三钠加入后很快变成灰色，续而转成黑色，随后逐渐稳定成酒红色，20min后停止加热。冷却至室温后4℃避光保存。
1.2.3 胶体金溶液的最佳PH值确定。取1mL的胶体金溶液8份，分别用0.2mol/L K2CO3将pH值调至5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0；分别加入0.2μg/mL降钙素原单克隆抗体100μL，混匀，静置10min后，加入100μL质量分数为10%为NaCl溶液，静置0.5h后观察胶体金颜色。胶体金颜色没有发生改变的最低pH值为胶体金溶液的最佳pH值。
1.2.4 确定最低蛋白稳定量。在标记前，应首先测定能稳定一定量胶体金所需要的最小蛋白用量。将胶体金溶液调至最佳PH值，抗原经高速离心除去大的聚集物，用5mmol/L PH8.0的PB溶液稀释至0.2mg/ml，将待标记降钙素原单克隆抗体逐级稀释后，各取等体积顺序加入一系列装有1ml胶体金的试管中，混匀；5min后，在上述各管内分别加入10%氯化钠溶液0.1ml，混匀，室温静置，用分光光度计OD580测定。
未加蛋白及加入蛋白量不足以稳定胶体金的试管，即呈现由红变蓝的聚沉现象，而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的试管则保持胶体金的红色不变。以此使胶体金红色不变而蛋白质含量最低的试管的蛋白量，即为稳定1ml胶体金的必需蛋白量，也即最低稳定量。在此基础上再加20%即为稳定1ml胶体金所需蛋白质的实际最适用量。
1.2.5 胶体金标记抗PCT单克隆抗体。
1.2.6 胶体金标记降钙素原单克隆抗体。将胶体金调至最适PH值，加入最低蛋白稳定量的抗PCT单克隆抗体。静置5min后加入过量BSA封闭，离心，用0.01mol/LTris溶液重悬，低速离心去除聚集物，上清液即为胶体金标记的抗体。
1.2.7 免疫层析试纸条的制备。免疫层析试纸条由样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜及吸收垫4个部分组成。样品垫和结合垫用玻璃纤维，吸收垫用吸水滤纸。以浓度为1.38mg/mL的羊抗鼠多克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线作为质控带；以浓度为0.9mg/mL的鼠抗降钙素原单克隆抗体在硝酸纤维素膜上划线作为检测带，参数0.1μL/mm划线，指控带与检测带间距约为7mm。划线后，将硝酸纤维素膜置于37℃培养箱中孵育2h。将吸收垫、样品垫及结合垫、硝酸纤维素膜叠加，组装成完整的层析条，然后切割层析条，宽度4mm/条，干燥避光保存。
1.2.8 检测及结果判读。在制备好的层析条的样品垫上手工加样100μL，15min后，检测带和指控带都出现红色为阳性，只有指控带出现红色为阴性，检测带和指控带均不显色，则为试剂失效，需换新的试纸条重测。 1.2.9 临床标本检测。用试纸条对160份进行检测，将检测结果与德国B.R.A.H.M.S GmbH公司商品化的降钙素原测定试剂盒比较，对试纸条特异性进行评价。
2 结果
2.1 最适标记胶体金PH值的确定。结果表明胶体金颜色未改变的最低pH值为7.0，因此胶体金标记降钙素原单克隆抗体的最适PH为7.0。
2.2 最低蛋白稳定量结果。分光光度计测定结果，以OD值为纵坐标，抗体用量为横坐标做一曲线，见图1。取曲线与横轴接近那一点的蛋白用量即为最小蛋白质稳定量，在此基础上再加20%即为稳定胶体金蛋白质实际用量，即选择12μg/mL的降钙素原单克隆抗体加入量作为实际最小蛋白标记量较为合适。
2.3 临床标本检测结果。胶体金试纸条与对比试剂对入选样本采用同步盲法进行检测，试验结束后进行比对，比较的结果采用2×2表统计，计算测量的一致性。
3 讨论
降钙素原（procalcitonin，PCT）是降钙素的前体，是由116个氨基酸组成、相对分子质量为127000的糖蛋白。PCT由神经内分泌细胞（包括甲状腺、肺和胰腺组织细胞）表达，经酶切分解为降钙素（CT）、羧基端肽和氨基端肽。PCT在人体内的半衰期为20～24h，稳定性好，在正常人血清中含量极低[2]。
胶体金标记技术是以胶体金作为示踪标志物或显色剂，应用于抗原抗体反应的一种新型免疫标记技术，现在已成功用于体外诊断制剂领域。在透射电镜下观察，理想的金颗粒是大小基本相等，均匀一致，无椭圆形及多角形的金颗粒存在。拍片放大后测量金颗粒直径，符合制备要求。小颗粒胶体金基本是圆球形，30～80nm金颗粒则多为偏心圆形[3]。如果金颗粒大小不等或有椭圆形、三角形金颗粒存在应重新制备，造成这种情况的主要原因一般与在加还原剂时没有迅速一次性加入以及搅拌不均匀有关；此外制备量的多少、容器的大小、加热的时间等也影响胶体金颗粒的大小。制备好的胶体金可因电解质、温度、金溶液的浓度变化而有不稳定和聚沉。因此，制备后最好在20天以内进行标记，室温或4℃保存，避免低温冻存[4]。
胶体金颗粒与蛋白质的结合一般通过静电感应、蛋白质疏水作用吸附于金颗粒表面，或通过蛋白质中半胱氨酸的硫残基与金颗粒的电子层发生配位结合。无论其作用机制为何，环境pH和离子强度是影响吸附的主要因素，一般只有在蛋白质等电点略偏碱的条件下二者才能牢固地结合。标记好的免疫胶体金纯化处理的目的是除去其中未标记的蛋白质、未充分标记的胶体金以及在标记过程中可能形成的各种聚合物。根据胶体金颗粒大小不同和所标记蛋白质的特性不同，选择并调整离心转速和离心时间可以达到一般的纯化目的[5]。
胶体金免疫层析试纸条的研制不仅在抗原抗体的选择、用量优化、层析材料的选择、胶体金的制备与标记等方面至关重要，而且缓冲系统的优化也必不可少。为确保试剂盒的稳定性，试纸条的组装须在洁净干燥的环境下进行，空气湿度<30%为宜。本试验制备的检测降钙素原的胶体金免疫层析试纸条经临床血清标本检测，检测结果与B.R.A.H.M.S GmbH公司商品化的降钙素原测定试剂盒比较，阳性符合率为96.6%，阴性符合率为97.2%，总符合率为96.9%，Kappa值为0.937。两种方法在灵敏度、特异性有较好的一致性。
参考文献
[1] 王蓉，陈雪雯，李桂珍.降钙素原的临床应用与研究进展[J].中国城乡企业卫生，2011，145：39-41
[2] Meisner M. Pathobiochemistry and clinical use of procalcitonin[J].Clin Chim Acta，2002，323（1-2）：17-29
[3] Bassab C，Syamal R.Manufacturing high-quality gold sol.IVD Technology，2001，8：46-54
[4] Hayat MA.Colloidal gold-principles，methods and applications.San Diego：Academic Press，1989，2-10
[5] Hermanson GT.Bioconjugate techniques.Academic Press，1996，593-602