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【摘 要】目的：探讨HLA-DRB1等位基因在中国青海藏族类风湿关节炎患者的分布及意义。方法：采用PCR-SSP（聚合酶链反应-序列特异性引物法）技术，对87例RA患者和90例正常对照的HLA-DRB1*01，04基因型进行检测。结果：HLA-DRB1* 04，在RA组的频率显著高于正常对照组（P =0.028，） HLA-DRB1* 01 在两组差别无显著意义（P =0.621）。结论：HLA-DRB1位点在青海地区藏族类风湿关节炎患者中的分布具有丰富的多态性， HLA-DRB1* 04可能是青海地区藏族类风湿关节炎患者的易感基因。
【关键词】类风湿关节炎；HLA-DRB1基因；等位基因；藏族
类风湿关节炎（ Rheum ato id Arthr itis， RA ）与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR基因在遗传上的联系在20世纪70年代被首先报道，研究人员发现HLA-DR4在70%的RA患者中出现，而在对照组中仅30%，具有 HLA-DR4基因的个体患RA的相对危险性大约为4-5倍。[1]
基于国内诸多学者对中国不同地区汉族RA人群HLA-DRB 1等位基因的研究，本研究在RA相关HLA-DRB1等位基因在全世界不同人种、不同种族中生物地理区分布不同的基础上，测定青海地区藏族人群RA病人中HLA-DRB1*04及HLA-DRB1*01等位基因的分布，探讨青海地区藏族人群中HLA-DRB1*04及HLA-DRB1*01等位基因与RA发病相关性。
1 材料与方法
1.1 研究对象
RA 组为2011年10月至2012 年8月于青海大学附属医院、青海省人民医院及青海省藏医院就诊的青海地区居住5年以上且无血缘关系的藏族人群RA 患者。其诊断依据为2010年ACR/EULAR联合颁布新的RA诊断标准。男性21 人，女性66人，平均年龄（44.4±14.2）岁，对照组为青海地区居住且无血缘关系的藏族健康体检人群 男性19人，女性71人，平均年龄（45.4±14.6）岁。两组均为藏族，排除其它自身免疫性疾病和严重心、肝、肾疾病，经统计学检验两组人员年龄、性别差异无统计学意义，均符合Hardy–Weinberg平衡定律。
1.2 研究方法
1.2.1樣本采集：收集所有研究对象清晨空腹静脉血7 mL， 其中2 mL贮于EDTA抗凝的试管中，-20℃保存， 用于基因组DNA的提取。
1.2.2基因组DNA的抽提： 采用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒（赛泰克生物科技有限公司），利用其独特的细胞裂解和血红素/蛋白沉淀技术， 结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法，从抗凝全血中得到并纯化基因组DNA， DNA样本保存在-20℃备用。
1.2.3 HLA-DRB1* 04， 01等位基因的检测：
采用PCR SSP法，按文献合成引物序列：DRB101-F TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT，DRB101-R CTGCACTGTGAAGCTCTCAC，产物长度 255bp；DRB104-F GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA，DRB104-R CTGCACTGTGAAGCTCTCAC，产物长度 260bp；hGH-F GCCTTCCCAACCATTCCCTTA，hGH-R TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC，产物长度 429bp。PCR扩增反应体系：2.5×Buffer V 6.0?l，目的基因上下游引物（5?M）各1.0?l，内参基因上下游引物（5?M）各0.4?l，KAPAHS Taq酶（5U/?l）0.1?l，模板DNA 1.0?l，ddH2O 6.5?l。反应程序如下： 95℃ 10 min； 95℃ 30 s， 58℃ 60 s， 72℃ 60 s， 共35个循环； 72℃ 10 min，终止。取PCR产物1μl，2.5%琼脂糖凝胶电泳，采用上海山富科学仪器有限公司的BioSens SC 810B凝胶成像系统拍照后观察记数。
1.3 数据处理采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，以（x±s）表示样本的均数， 两样本均数的比较采用t 检验，两独立样本率的比较采用χ2，定义双侧P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
177例样品DRB1* 04和01分型PCR扩增如图1， 2所示，内参基因片段均被扩增。得到分型结果如下：DRB1* 04在RA 组的频率显著高于对照组（P =0.028）； 它们的比值比（OR） （见表1）。HLA-DRB1*01低于对照组， 但两组差别无统计学意义（P=0.621）。（见表2）
3 讨论
类风湿关节炎是一种以慢性、进行性、侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病。病因尚不明确，但遗传和环境在发病机制中起着潜在的作用。
人类主要组织相容性抗原（MHC）拥有多态基因位点，继承了表达于MHC基因位点上某一特定基因的人易患RA，这种特定基因被称为与疾病相关的等位基因。对人类而言，位于细胞表面编码MHC基因位点的细胞表面的蛋白被称为人类白细胞抗原（HLA）。迄今为止，研究最深入的、与RA发病相关性最强的是HLAⅡ类分子。HLA基因不但可以将抗原递呈给T细胞，诱导其活化，并且在胸腺中选择释放至外周血中的T细胞。参与RA发病的HLAⅡ类分子对启动T细胞反应有着重要作用，同时它在关节内发挥着更多的局部作用。[2]
HLAⅡ类分子HLA-DRB1等位基因是第一个与RA有关的易感性基因。与RA 易感性相关的HLA-DRB1共享表位（QK/RRAA）序列位于α-螺旋结构的第70-74位氨基酸[3]。HLA-DRB1*0401，HLA-DRB1*0404，HLA-DRB1*0101，HLA-DRB1*0405和HLA-DRB1*1402均携带这段序列。在文献中，HLA-DRB1*04等位基因被报道在许多人群中与RA相关。其他与RA有关的等位基因HLA-DRB1*01在法国、拉丁美洲、亚洲和高加索有报道[4-9]。研究发现，在不同类型RA患者中，如在多关节型RF阳性的RA患者中，DRB1*0401和*0404出现的频率最高。 本研究采用SSP（序列特異性引物）多重PCR技术扩增87例RA患者和90例正常对照HLA-DRB1等位基因， 低分结果共2亚型， 其中HLA-DRB1* 04，在RA组的频率显著高于正常对照组（P =0.028，） HLA-DRB1* 01 在两组差别无显著意义（P =0.621）。本次研究发现HLA-DRB1* 04可能是青海地区藏族类风湿关节炎患者的易感基因，与国内学者苏茵[10]、蒋真[11]研究结果相似。
综上所述，HLA-DRB1* 04位点在青海地区藏族类风湿关节炎患者中的分布具有丰富的多态性， HLA-DRB1* 04可能是青海地区藏族类风湿关节炎患者的易感基因。我国幅员辽阔，有必要在中国多个地区、多民族中进一步探索HLA-DRB1多态性与RA发病相关性，并进一步探讨其作用。
参考文献：
[1] MacGregor AJ，Snieder H，Rigby AS et al.Characterizing the quantitative genetic contribution to rheumatoid arthritis using data from twins.Arthritis Rheum 2000；43：30-7.
[2] Cranney A，Goldstein R，Pham B，et a1.（1999）A meaure of limited joint motion and deformity correlates with HLA—DRB1 and DQB1 alleles in patients with rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis.58（11）：703—708
[3]Fleming RA：An overview of cyclophosphamide and ifosfamide pharmacology， pharmacotheraphy 17：1465-1545，1997.
[4] Yan Z， Ferucci ED， Geraghty DE， Yang Y， Lanier AP， Smith WPet al （2007） Resequencing of the human major histocompatibilitycomplex in patients with rheumatoid arthritis and healthy controls in Alaska Natives of Southeast Alaska. Tissue Antigens70：487–494
[5] Reviron D， Foutrier C， Guist S， Mercier P， Roudier J （2001）DRB1 alleles in polymyalgia rheumatica and rheumatoid arthritis in southern France. Eur J Immunogenet 28：83–87
[6] Takeuchi F， Nakano K， Matsuta K， Nabeta H， Bannai M， TanimotoK， Ito K （1996） Positive and negative association of HLA-DR genotypes with Japanese rheumatoid arthritis. Clin ExpRheumatol 14：17–22
[7]Kinikli G， Ates? A， Turgay M， Akay G， Kinikli S， Tokgo¨z G（2003） HLA-DRB1 genes and disease severity in rheumatoid arthritis in Turkey. Scand J Rheumatol 32：277–280
[8] Milicic A， Lee D， Brown MA， Darke C， Wordsworth BP （2002）HLA-DR/DQ haplotype in rheumatoid arthritis： novel allelic associations in UK Caucasians. J Rheumatol 29：1821–1826
[9] Jun KR， Choi SE， Cha CH， Oh HB， Heo YS， Ahn HY， Lee KJ（2007） Meta-analysis of the association between HLA-DRB1 allele and rheumatoid arthritis susceptibility in Asian populations.J Korean Med Sci 22：973–980
[10] 苏茵，栗占国，贾汝琳等.HLA-DRB1*04亚型的氨基酸序列与类风湿关节炎易感相关性分析[J].中华风湿病学杂志，2004，8（04）：215-218
[11] 蒋真，李向培，钱龙. HLA-DRB1等位基因分型与类风湿关节炎相关性研究.安徽医药，2010，14（11）：1299-1301
【关键词】类风湿关节炎；HLA-DRB1基因；等位基因；藏族
类风湿关节炎（ Rheum ato id Arthr itis， RA ）与人类白细胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）-DR基因在遗传上的联系在20世纪70年代被首先报道，研究人员发现HLA-DR4在70%的RA患者中出现，而在对照组中仅30%，具有 HLA-DR4基因的个体患RA的相对危险性大约为4-5倍。[1]
基于国内诸多学者对中国不同地区汉族RA人群HLA-DRB 1等位基因的研究，本研究在RA相关HLA-DRB1等位基因在全世界不同人种、不同种族中生物地理区分布不同的基础上，测定青海地区藏族人群RA病人中HLA-DRB1*04及HLA-DRB1*01等位基因的分布，探讨青海地区藏族人群中HLA-DRB1*04及HLA-DRB1*01等位基因与RA发病相关性。
1 材料与方法
1.1 研究对象
RA 组为2011年10月至2012 年8月于青海大学附属医院、青海省人民医院及青海省藏医院就诊的青海地区居住5年以上且无血缘关系的藏族人群RA 患者。其诊断依据为2010年ACR/EULAR联合颁布新的RA诊断标准。男性21 人，女性66人，平均年龄（44.4±14.2）岁，对照组为青海地区居住且无血缘关系的藏族健康体检人群 男性19人，女性71人，平均年龄（45.4±14.6）岁。两组均为藏族，排除其它自身免疫性疾病和严重心、肝、肾疾病，经统计学检验两组人员年龄、性别差异无统计学意义，均符合Hardy–Weinberg平衡定律。
1.2 研究方法
1.2.1樣本采集：收集所有研究对象清晨空腹静脉血7 mL， 其中2 mL贮于EDTA抗凝的试管中，-20℃保存， 用于基因组DNA的提取。
1.2.2基因组DNA的抽提： 采用AxyPrep血基因组DNA小量试剂盒（赛泰克生物科技有限公司），利用其独特的细胞裂解和血红素/蛋白沉淀技术， 结合DNA制备膜选择性地吸附DNA的方法，从抗凝全血中得到并纯化基因组DNA， DNA样本保存在-20℃备用。
1.2.3 HLA-DRB1* 04， 01等位基因的检测：
采用PCR SSP法，按文献合成引物序列：DRB101-F TTGTGGCAGCTTAAGTTTGAAT，DRB101-R CTGCACTGTGAAGCTCTCAC，产物长度 255bp；DRB104-F GTTTCTTGGAGCAGGTTAAACA，DRB104-R CTGCACTGTGAAGCTCTCAC，产物长度 260bp；hGH-F GCCTTCCCAACCATTCCCTTA，hGH-R TCACGGATTTCTGTTGTGTTTC，产物长度 429bp。PCR扩增反应体系：2.5×Buffer V 6.0?l，目的基因上下游引物（5?M）各1.0?l，内参基因上下游引物（5?M）各0.4?l，KAPAHS Taq酶（5U/?l）0.1?l，模板DNA 1.0?l，ddH2O 6.5?l。反应程序如下： 95℃ 10 min； 95℃ 30 s， 58℃ 60 s， 72℃ 60 s， 共35个循环； 72℃ 10 min，终止。取PCR产物1μl，2.5%琼脂糖凝胶电泳，采用上海山富科学仪器有限公司的BioSens SC 810B凝胶成像系统拍照后观察记数。
1.3 数据处理采用SPSS 13.0 统计软件进行统计学分析，以（x±s）表示样本的均数， 两样本均数的比较采用t 检验，两独立样本率的比较采用χ2，定义双侧P<0.05 为差异有统计学意义。
2 结果
177例样品DRB1* 04和01分型PCR扩增如图1， 2所示，内参基因片段均被扩增。得到分型结果如下：DRB1* 04在RA 组的频率显著高于对照组（P =0.028）； 它们的比值比（OR） （见表1）。HLA-DRB1*01低于对照组， 但两组差别无统计学意义（P=0.621）。（见表2）
3 讨论
类风湿关节炎是一种以慢性、进行性、侵蚀性关节炎为主要表现的全身性自身免疫病。病因尚不明确，但遗传和环境在发病机制中起着潜在的作用。
人类主要组织相容性抗原（MHC）拥有多态基因位点，继承了表达于MHC基因位点上某一特定基因的人易患RA，这种特定基因被称为与疾病相关的等位基因。对人类而言，位于细胞表面编码MHC基因位点的细胞表面的蛋白被称为人类白细胞抗原（HLA）。迄今为止，研究最深入的、与RA发病相关性最强的是HLAⅡ类分子。HLA基因不但可以将抗原递呈给T细胞，诱导其活化，并且在胸腺中选择释放至外周血中的T细胞。参与RA发病的HLAⅡ类分子对启动T细胞反应有着重要作用，同时它在关节内发挥着更多的局部作用。[2]
HLAⅡ类分子HLA-DRB1等位基因是第一个与RA有关的易感性基因。与RA 易感性相关的HLA-DRB1共享表位（QK/RRAA）序列位于α-螺旋结构的第70-74位氨基酸[3]。HLA-DRB1*0401，HLA-DRB1*0404，HLA-DRB1*0101，HLA-DRB1*0405和HLA-DRB1*1402均携带这段序列。在文献中，HLA-DRB1*04等位基因被报道在许多人群中与RA相关。其他与RA有关的等位基因HLA-DRB1*01在法国、拉丁美洲、亚洲和高加索有报道[4-9]。研究发现，在不同类型RA患者中，如在多关节型RF阳性的RA患者中，DRB1*0401和*0404出现的频率最高。 本研究采用SSP（序列特異性引物）多重PCR技术扩增87例RA患者和90例正常对照HLA-DRB1等位基因， 低分结果共2亚型， 其中HLA-DRB1* 04，在RA组的频率显著高于正常对照组（P =0.028，） HLA-DRB1* 01 在两组差别无显著意义（P =0.621）。本次研究发现HLA-DRB1* 04可能是青海地区藏族类风湿关节炎患者的易感基因，与国内学者苏茵[10]、蒋真[11]研究结果相似。
综上所述，HLA-DRB1* 04位点在青海地区藏族类风湿关节炎患者中的分布具有丰富的多态性， HLA-DRB1* 04可能是青海地区藏族类风湿关节炎患者的易感基因。我国幅员辽阔，有必要在中国多个地区、多民族中进一步探索HLA-DRB1多态性与RA发病相关性，并进一步探讨其作用。
参考文献：
[1] MacGregor AJ，Snieder H，Rigby AS et al.Characterizing the quantitative genetic contribution to rheumatoid arthritis using data from twins.Arthritis Rheum 2000；43：30-7.
[2] Cranney A，Goldstein R，Pham B，et a1.（1999）A meaure of limited joint motion and deformity correlates with HLA—DRB1 and DQB1 alleles in patients with rheumatoid arthritis[J].Ann Rheum Dis.58（11）：703—708
[3]Fleming RA：An overview of cyclophosphamide and ifosfamide pharmacology， pharmacotheraphy 17：1465-1545，1997.
[4] Yan Z， Ferucci ED， Geraghty DE， Yang Y， Lanier AP， Smith WPet al （2007） Resequencing of the human major histocompatibilitycomplex in patients with rheumatoid arthritis and healthy controls in Alaska Natives of Southeast Alaska. Tissue Antigens70：487–494
[5] Reviron D， Foutrier C， Guist S， Mercier P， Roudier J （2001）DRB1 alleles in polymyalgia rheumatica and rheumatoid arthritis in southern France. Eur J Immunogenet 28：83–87
[6] Takeuchi F， Nakano K， Matsuta K， Nabeta H， Bannai M， TanimotoK， Ito K （1996） Positive and negative association of HLA-DR genotypes with Japanese rheumatoid arthritis. Clin ExpRheumatol 14：17–22
[7]Kinikli G， Ates? A， Turgay M， Akay G， Kinikli S， Tokgo¨z G（2003） HLA-DRB1 genes and disease severity in rheumatoid arthritis in Turkey. Scand J Rheumatol 32：277–280
[8] Milicic A， Lee D， Brown MA， Darke C， Wordsworth BP （2002）HLA-DR/DQ haplotype in rheumatoid arthritis： novel allelic associations in UK Caucasians. J Rheumatol 29：1821–1826
[9] Jun KR， Choi SE， Cha CH， Oh HB， Heo YS， Ahn HY， Lee KJ（2007） Meta-analysis of the association between HLA-DRB1 allele and rheumatoid arthritis susceptibility in Asian populations.J Korean Med Sci 22：973–980
[10] 苏茵，栗占国，贾汝琳等.HLA-DRB1*04亚型的氨基酸序列与类风湿关节炎易感相关性分析[J].中华风湿病学杂志，2004，8（04）：215-218
[11] 蒋真，李向培，钱龙. HLA-DRB1等位基因分型与类风湿关节炎相关性研究.安徽医药，2010，14（11）：1299-1301