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摘要：目的 观察三七总皂苷对脑出血大鼠脑组织含水量及凝血酶的影响，探讨其对脑出血的作用机制。方法 SD雄性大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、治疗组，分别观察6、24、48、72 h及7 d 5个时间点。采用尾壳核注入胶原酶肝素钠生理盐水溶液法建立大鼠脑出血模型，治疗组给予三七总皂苷腹腔注射，每日1次，采用干湿重法测量脑组织含水量，检测48 h纤维蛋白原含量（FIB）和凝血酶凝结时间（TT）。结果 各时点模型组脑含水量与空白组、假手术组比较明显升高，差异有统计学意义（P<0.05）；除6 h时点外，治疗组各时点与模型组和治疗组比较，脑含水量明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）。与模型组比较，治疗组FIB明显降低，差异有统计学意义（P<0.05）；治疗组TT下降不明显，差异无统计学意义（P>0.05）。结论 三七总皂苷通过下调脑出血大鼠脑组织含水量、FIB含量及TT达到治疗脑出血的目的。
关键词：脑出血；三七总皂苷；脑含水量；凝血酶；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0046-03
脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是最危重的一种卒中类型，该病发病率、病死率、致残率高[1-3]。ICH具有发病急、变化快、病情危重、病机复杂等特点，急性期救治对提高抢救成功率和患者生存质量具有重要意义。目前ICH急性期的内科治疗多限于脱水降颅压、调整血压、改善营养代谢和防治并发症等对症支持疗法，缺乏针对性强的治疗手段，多数患者留有神经功能缺损。ICH后脑损伤的机制很多，包括血肿扩大、血肿周围组织缺血（缺血性半暗带）、血肿周围组织脑水肿等[4]。在血肿形成过程中和形成后都存在脑水肿，其中凝血酶的作用受到广泛关注。它是凝血级联反应的基本成分，脑出血后迅速生成。脑水肿和凝血酶都具有神经毒性，破坏神经的正常功能。本研究通过观察三七总皂苷对脑出血大鼠凝血酶和神经功能评分的影响，探讨其对脑出血的治疗作用。
1 实验材料
1.1 动物
SD雄性大鼠175只，体质量230～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。
1.2 药物
三七总皂苷，广西梧州制药集团股份有限公司，批号12081212，150 mg/支。
1.3 仪器与试剂
立体定位仪（日本stoelting公司），电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司，DHG-9145A型），离心机（eppendorf Centrifuge 5810R）。Ⅳ型胶原酶（Sigma公司，货号C-5138）；水合氯醛（国家集团化学试剂有限公司，批号20111024），用生理盐水制成10%浓度。
2 实验方法
2.1 分组
大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、治疗组，各组分别设6、24、48、72 h及7 d 5个时间点。空白组每时点5只大鼠，其余各组每时点10只大鼠。
2.2 造模与给药
脑出血模型制备参考文献[5]方法。以10%水合氯醛0.4 mg/100 g）腹腔麻醉，俯卧固定大鼠于动物头颅立体定位仪，头皮丁字切开，取前囟为原点，向右3 mm、向后1 mm、深度5.5 mm为注射点（尾壳核），骨钻钻开颅骨，进针后缓慢注射药物溶液，留针5 min，缓慢退针，切口撒适量青霉素钾粉，缝合皮肤后回笼饲养。空白组不做任何处理，普通饲养，自由饮水。假手术组颅内注入2 μL灭菌生理盐水，普通饲养，腹腔注射生理盐水（1 mL/100 g）。模型组注射胶原酶肝素钠生理盐水溶液2.0 μL（每1 μL溶液含Ⅳ型胶原酶0.2 U及肝素2 U），普通饲养，腹腔注射生理盐水（1 mL/100 g）。治疗组腹腔注射三七总皂苷注射液（血栓通粉针150 mg/支） 7.2 mg/100 g，于造模后立即给药1次，然后每24 h给药1次。三七总皂苷注射液配制：150 mg溶入15 mL生理盐水中，1 mL溶液中含10 g血栓通针粉，每100 g体质量给药0.72 mL。
2.3 脑含水量测定
取血后立即断头取出脑组织，将各时间点脑组织分别用电子分析天平称质量（精确到0.1 mg），然后置入110 ℃恒温箱中烘干至恒重，24 h后取出立即称干重。按Billiot公式[脑含水量=（湿重-干重）/湿重×100%]计算。
2.4 纤维蛋白原含量与凝血酶凝结时间检测
将每组各时点大鼠在相应时间点麻醉，剪开腹腔，分离出腹主动脉，一次性采血针和枸橼酸钠抗凝管采血，采血后，上下缓慢混匀，然后迅速插入冰里， 4 ℃、3000 r/min离心10 min，取上清分装备用。脑含水量在48 h达到峰值，因此取48 h血浆检测纤维蛋白原含量（FIB）和凝血酶凝结时间（TT）。
3 统计方法学
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 三七总皂苷对大鼠脑含水量的影响
与假手术组比较，空白组各时点脑含水量无明显变化，差异无统计学意义。与模型组比较，假手术组各时点脑含水量比较变化明显，差异有统计学意义（P<0.05），模型组脑含水量6 h开始升高，48 h达到高峰，以后逐渐下降。除各组6 h外，其余各组各时点模型组和治疗组比较，脑含水量有明显变化，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
4.2 三七总皂苷对大鼠血浆纤维蛋白原含量和凝血酶凝结时间的影响
治疗组大鼠FIB含量降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；而TT变化组间比较差异无统计学意义，但从均值看，治疗组较模型组下降。见表2。 5 讨论
ICH后最初的损伤是由血肿扩大导致机械性压力所造成的；在血肿形成过程中和形成后，都存在水肿，造成对脑组织的进一步损伤[4]。在脑水肿发生机制中，凝血酶的作用受到了广泛关注。它是凝血级联反应的基本成分，脑出血后迅速生成。凝血酶是一种血清丝氨酸蛋白酶，由无活性的凝血酶原产生，催化FIB转变为纤维蛋白。凝血酶神经作用机制较为复杂，凝血酶在脑出血后除参与凝血外，还是一种重要的神经毒性介质，它能引起脑水肿，破坏血脑屏障和产生细胞毒性作用，引起神经元损伤[6]。Vaughan等[7]研究发现小剂量凝血酶具有神经保护作用，大剂量则具有细胞毒性作用。当出血进入大脑后，主要由外源性凝血途径产生大剂量凝血酶，持续直至凝血酶原耗尽，依次激活产生脑水肿的途径[8]。凝血酶对神经细胞的毒性作用以及对血脑屏障的损伤可能是ICH后脑水肿加重的重要机制。总之，凝血酶本身和凝血过程中产生的一系列物质是引起脑出血早期脑水肿的重要因素。
ICH属中医“中风”范畴，“离经之血即为瘀”，发病之初，脑络损而血溢，离经之血为瘀血，血行不畅，损伤脑络、脑髓，进一步加重了出血和血瘀。一定程度上，“瘀血”病机与凝血、炎症反应、脑水肿、组织缺血等病理机制是相吻合的。现代医学影像呈现异常密度影，表明出血性中风为“恶血留内”，治疗应以活血化瘀为第一要义，瘀血是痰、热、毒的源头，故需澄其源。三七具有“止血不留瘀”的特点，其活性成分三七总皂苷，可改善血肿周围微循环、降低血脑屏障通透性、清除自由基、减轻脑水肿。三七作为活血化瘀法的代表药物，具有化瘀止血、活血定痛之功效，止血且不留瘀，适用于ICH血肿形成、继发缺血及局部代谢障碍等形成的瘀血证。
本实验结果表明，大鼠脑出血造模后6 h，脑含水量明显升高，到48 h达到高峰，以后逐渐下降。三七总皂苷腹腔给药后，6 h组作用不明显，可能与药物作用时间段有关系，各组其余时点给药后脑含水量明显下降，说明三七总皂苷对减轻大鼠脑出血后脑水肿是有效的，为临床活血化瘀药治疗ICH提供了实验基础。FIB含量在用药后下降，说明血液中FIB减少，三七发挥了活血行瘀的作用。而TT变化虽然差异无统计学意义，但从均值看，用药后较模型组下降，说明三七在发挥止血的作用，由此，三七止血活血的作用雏形已经显现。TT变化差异无统计学意义的原因可能是48 h时间点没有捕捉到作用高峰，也可能是样本量偏小所致，后期实验将增加时间点和样本量加以完善。
参考文献：
[1] Feigin VL. Stroke in developing countries：can the epidemic be stopped and outcomes improved？[J]. Lancet Neurol，2007，6（2）：94-97.
[2] O'Donnell M， Yusuf S. Tackling the global burden of stroke：the need for large-scale international studies[J]. Lancet Neuro1， 2009，9（4）：306-307.
[3] Biffi A， Battey TW， Ayres AM， et al. Warfarin-related intraventricular hemorrhage：imaging and outcome[J]. Neurology， 2011，77（20）：1840-1846.
[4] Gong Y， Hua Y， Keep RF， et al. Intracerebral hemorrhage：effects of aging on brain edema and neurological deficits[J]. Stroke， 2004，35（11）：2571-2575.
[5] Rosenberg GA， Mun-Bryce S， Wesley M， et al. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J]. Stroke，1990，21（5）：801-807.
[6] 郑国庆.凝血酶在脑出血后的作用[J].心脑血管病防治，2004，6（4）：56-58.
[7] Vaughan PJ， Pike CJ， Cotman CW， et al. Thrombin receptor activation protects neurons and astrocytes from cell death produced by environmental insults[J]. J Neurosei，1995，15（7）：5389-5401.
[8] 吴文辉，许丽珍.凝血酶致脑水肿的实验观察[J].中国血液流变学杂志，2003，13（2）：133-134.
（收稿日期：2013-07-16，编辑：华强）
关键词：脑出血；三七总皂苷；脑含水量；凝血酶；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0046-03
脑出血（intracerebral hemorrhage，ICH）是最危重的一种卒中类型，该病发病率、病死率、致残率高[1-3]。ICH具有发病急、变化快、病情危重、病机复杂等特点，急性期救治对提高抢救成功率和患者生存质量具有重要意义。目前ICH急性期的内科治疗多限于脱水降颅压、调整血压、改善营养代谢和防治并发症等对症支持疗法，缺乏针对性强的治疗手段，多数患者留有神经功能缺损。ICH后脑损伤的机制很多，包括血肿扩大、血肿周围组织缺血（缺血性半暗带）、血肿周围组织脑水肿等[4]。在血肿形成过程中和形成后都存在脑水肿，其中凝血酶的作用受到广泛关注。它是凝血级联反应的基本成分，脑出血后迅速生成。脑水肿和凝血酶都具有神经毒性，破坏神经的正常功能。本研究通过观察三七总皂苷对脑出血大鼠凝血酶和神经功能评分的影响，探讨其对脑出血的治疗作用。
1 实验材料
1.1 动物
SD雄性大鼠175只，体质量230～250 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，动物许可证号：SCXK（京）2012-0001。
1.2 药物
三七总皂苷，广西梧州制药集团股份有限公司，批号12081212，150 mg/支。
1.3 仪器与试剂
立体定位仪（日本stoelting公司），电热恒温鼓风干燥箱（上海一恒科技有限公司，DHG-9145A型），离心机（eppendorf Centrifuge 5810R）。Ⅳ型胶原酶（Sigma公司，货号C-5138）；水合氯醛（国家集团化学试剂有限公司，批号20111024），用生理盐水制成10%浓度。
2 实验方法
2.1 分组
大鼠随机分为空白组、假手术组、模型组、治疗组，各组分别设6、24、48、72 h及7 d 5个时间点。空白组每时点5只大鼠，其余各组每时点10只大鼠。
2.2 造模与给药
脑出血模型制备参考文献[5]方法。以10%水合氯醛0.4 mg/100 g）腹腔麻醉，俯卧固定大鼠于动物头颅立体定位仪，头皮丁字切开，取前囟为原点，向右3 mm、向后1 mm、深度5.5 mm为注射点（尾壳核），骨钻钻开颅骨，进针后缓慢注射药物溶液，留针5 min，缓慢退针，切口撒适量青霉素钾粉，缝合皮肤后回笼饲养。空白组不做任何处理，普通饲养，自由饮水。假手术组颅内注入2 μL灭菌生理盐水，普通饲养，腹腔注射生理盐水（1 mL/100 g）。模型组注射胶原酶肝素钠生理盐水溶液2.0 μL（每1 μL溶液含Ⅳ型胶原酶0.2 U及肝素2 U），普通饲养，腹腔注射生理盐水（1 mL/100 g）。治疗组腹腔注射三七总皂苷注射液（血栓通粉针150 mg/支） 7.2 mg/100 g，于造模后立即给药1次，然后每24 h给药1次。三七总皂苷注射液配制：150 mg溶入15 mL生理盐水中，1 mL溶液中含10 g血栓通针粉，每100 g体质量给药0.72 mL。
2.3 脑含水量测定
取血后立即断头取出脑组织，将各时间点脑组织分别用电子分析天平称质量（精确到0.1 mg），然后置入110 ℃恒温箱中烘干至恒重，24 h后取出立即称干重。按Billiot公式[脑含水量=（湿重-干重）/湿重×100%]计算。
2.4 纤维蛋白原含量与凝血酶凝结时间检测
将每组各时点大鼠在相应时间点麻醉，剪开腹腔，分离出腹主动脉，一次性采血针和枸橼酸钠抗凝管采血，采血后，上下缓慢混匀，然后迅速插入冰里， 4 ℃、3000 r/min离心10 min，取上清分装备用。脑含水量在48 h达到峰值，因此取48 h血浆检测纤维蛋白原含量（FIB）和凝血酶凝结时间（TT）。
3 统计方法学
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，多组间比较采用单因素方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 三七总皂苷对大鼠脑含水量的影响
与假手术组比较，空白组各时点脑含水量无明显变化，差异无统计学意义。与模型组比较，假手术组各时点脑含水量比较变化明显，差异有统计学意义（P<0.05），模型组脑含水量6 h开始升高，48 h达到高峰，以后逐渐下降。除各组6 h外，其余各组各时点模型组和治疗组比较，脑含水量有明显变化，差异有统计学意义（P<0.05）。见表1。
4.2 三七总皂苷对大鼠血浆纤维蛋白原含量和凝血酶凝结时间的影响
治疗组大鼠FIB含量降低，与模型组比较，差异有统计学意义（P<0.05）；而TT变化组间比较差异无统计学意义，但从均值看，治疗组较模型组下降。见表2。 5 讨论
ICH后最初的损伤是由血肿扩大导致机械性压力所造成的；在血肿形成过程中和形成后，都存在水肿，造成对脑组织的进一步损伤[4]。在脑水肿发生机制中，凝血酶的作用受到了广泛关注。它是凝血级联反应的基本成分，脑出血后迅速生成。凝血酶是一种血清丝氨酸蛋白酶，由无活性的凝血酶原产生，催化FIB转变为纤维蛋白。凝血酶神经作用机制较为复杂，凝血酶在脑出血后除参与凝血外，还是一种重要的神经毒性介质，它能引起脑水肿，破坏血脑屏障和产生细胞毒性作用，引起神经元损伤[6]。Vaughan等[7]研究发现小剂量凝血酶具有神经保护作用，大剂量则具有细胞毒性作用。当出血进入大脑后，主要由外源性凝血途径产生大剂量凝血酶，持续直至凝血酶原耗尽，依次激活产生脑水肿的途径[8]。凝血酶对神经细胞的毒性作用以及对血脑屏障的损伤可能是ICH后脑水肿加重的重要机制。总之，凝血酶本身和凝血过程中产生的一系列物质是引起脑出血早期脑水肿的重要因素。
ICH属中医“中风”范畴，“离经之血即为瘀”，发病之初，脑络损而血溢，离经之血为瘀血，血行不畅，损伤脑络、脑髓，进一步加重了出血和血瘀。一定程度上，“瘀血”病机与凝血、炎症反应、脑水肿、组织缺血等病理机制是相吻合的。现代医学影像呈现异常密度影，表明出血性中风为“恶血留内”，治疗应以活血化瘀为第一要义，瘀血是痰、热、毒的源头，故需澄其源。三七具有“止血不留瘀”的特点，其活性成分三七总皂苷，可改善血肿周围微循环、降低血脑屏障通透性、清除自由基、减轻脑水肿。三七作为活血化瘀法的代表药物，具有化瘀止血、活血定痛之功效，止血且不留瘀，适用于ICH血肿形成、继发缺血及局部代谢障碍等形成的瘀血证。
本实验结果表明，大鼠脑出血造模后6 h，脑含水量明显升高，到48 h达到高峰，以后逐渐下降。三七总皂苷腹腔给药后，6 h组作用不明显，可能与药物作用时间段有关系，各组其余时点给药后脑含水量明显下降，说明三七总皂苷对减轻大鼠脑出血后脑水肿是有效的，为临床活血化瘀药治疗ICH提供了实验基础。FIB含量在用药后下降，说明血液中FIB减少，三七发挥了活血行瘀的作用。而TT变化虽然差异无统计学意义，但从均值看，用药后较模型组下降，说明三七在发挥止血的作用，由此，三七止血活血的作用雏形已经显现。TT变化差异无统计学意义的原因可能是48 h时间点没有捕捉到作用高峰，也可能是样本量偏小所致，后期实验将增加时间点和样本量加以完善。
参考文献：
[1] Feigin VL. Stroke in developing countries：can the epidemic be stopped and outcomes improved？[J]. Lancet Neurol，2007，6（2）：94-97.
[2] O'Donnell M， Yusuf S. Tackling the global burden of stroke：the need for large-scale international studies[J]. Lancet Neuro1， 2009，9（4）：306-307.
[3] Biffi A， Battey TW， Ayres AM， et al. Warfarin-related intraventricular hemorrhage：imaging and outcome[J]. Neurology， 2011，77（20）：1840-1846.
[4] Gong Y， Hua Y， Keep RF， et al. Intracerebral hemorrhage：effects of aging on brain edema and neurological deficits[J]. Stroke， 2004，35（11）：2571-2575.
[5] Rosenberg GA， Mun-Bryce S， Wesley M， et al. Collagenase-induced intracerebral hemorrhage in rats[J]. Stroke，1990，21（5）：801-807.
[6] 郑国庆.凝血酶在脑出血后的作用[J].心脑血管病防治，2004，6（4）：56-58.
[7] Vaughan PJ， Pike CJ， Cotman CW， et al. Thrombin receptor activation protects neurons and astrocytes from cell death produced by environmental insults[J]. J Neurosei，1995，15（7）：5389-5401.
[8] 吴文辉，许丽珍.凝血酶致脑水肿的实验观察[J].中国血液流变学杂志，2003，13（2）：133-134.
（收稿日期：2013-07-16，编辑：华强）