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摘要：目的 观察四神丸对溃疡性结肠炎（UC）模型大鼠结肠组织中核转录因子κB p65（NF-κB p65）基因和蛋白表达的影响，探讨其作用机制。方法 将实验大鼠分为空白组、模型组、四神丸组和柳氮磺胺嘧啶（SASP）组，采用TNBS/乙醇溶液灌肠法造模，四神丸组给予四神丸浸膏剂5 g/kg灌胃，SASP组给予0.3 g/kg SASP灌胃，空白组和模型组灌服等体积生理盐水。肉眼观察各组大鼠结肠大体形态损伤并评分，采用免疫组化和反转录法检测NF-κB p65蛋白和基因表达水平。结果 肉眼观察，模型组大鼠结肠组织黏膜层可见炎症和溃疡形成，与空白组比较，差异有统计学意义（P<0.05）。模型组大鼠结肠组织NF-κB p65基因和蛋白表达均高于空白组，差异有统计学意义（P<0.01）；四神丸组NF-κB p65基因和蛋白表达均较模型组降低，差异有统计学意义（P<0.05，P<0.01）。结论 四神丸对UC具有治疗作用，其机制可能与激活NF-κB信号通路有关。
关键词：四神丸；溃疡性结肠炎；核转录因子κB p65；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0049-04
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种主要累及直肠、结肠黏膜的慢性非特异性炎症，临床以腹痛、腹泻、黏液脓血便为特征。目前其病因和发病机制尚不十分明确，该病复发率高，且缠绵难愈，有发生癌变的可能性，临床上缺乏特异性治疗药物[1-2]。核转录因子（NF）-κB是一种多功能核转录因子，具有广泛的生物学活性，在机体免疫炎症反应中起着重要作用[3]。现有研究显示，NF-κB p65在UC的发生发展中，作为一种重要的转录因子，是多种信号途径的汇聚点，在调节炎性反应的基因中起着关键作用[3]，但对于NF-κB p65在UC肠道炎症中的具体作用机制还需要进一步探讨。本实验在前期工作的基础上，进一步观察四神丸对UC模型大鼠结肠黏膜NF-κB p65蛋白和基因表达的影响，以期探讨四神丸治疗UC的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
采用SPF级Wistar大鼠40只，体质量（180±10）g，雌雄各半，甘肃中医学院科研实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK（甘）2004-0006。
1.2 试剂
Trizol试剂（批号19919）、琼脂糖（批号0000101394）均购自Invitrogen公司；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）：美国Sigma公司生产，批号2008162；反转录试剂盒（批号0000007526）、PCR试剂盒（批号108030404）均购自Promega Corporation。一抗NF-κB p65、SP免疫组化染色试剂盒、DAB染色试剂盒（北京博奥森生物工程开发有限公司产品）。
1.3 仪器
美国BIO-RAD凝胶成像仪、电泳槽、电泳仪，美国BIO-RAD S1000TM型PCR仪，德国3-16PK型通用台式高速离心机，海尔DM-86L626型立式超低温冰箱，美国Bio-RAd核酸定量分析仪，成都太盟BI-2000图像分析系统之免疫组化分析系统。
1.4 药物
四神丸由甘肃中医学院附属医院药剂室制备。按照《证治准绳》原方2∶4∶2∶1∶2比例取肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴茱萸、大枣，用8倍量70%的乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取药渣。合并3次醇提取液，滤过，滤液减压回收乙醇后得醇提取浓缩液，醇提取浓缩液干燥得干膏，干膏粉碎成细粉，加入挥发油。实验用不含赋形剂的浸膏，4 ℃冰箱保存备用。柳氮磺吡啶（SASP）每片0.25 g，上海三维制药有限公司生产，国药准字H31020450。
2 实验方法
2.1 造模
参考文献[4-5]，采用TNBS/乙醇溶液灌肠法制作UC大鼠模型。将Wistar大鼠40只，禁食（不禁水）24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3 mL/100 g）后，一次性将TNBS/乙醇液（100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 mL）溶液用橡胶输液管轻缓注入大鼠距肛门约7～8 cm深的肠腔内，留置数分钟。然后用针头抽取一定量的空气，同样方法注入大鼠肠腔，防止溶液外漏，让动物保持平躺状态，自然清醒。空白组大鼠采用同样方法等量生理盐水灌肠。
2.2 分组与给药
将实验动物分为空白组、模型组、四神丸组和SASP组，每组10只。除空白组外，均以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 mL混合试剂灌肠。四神丸组均给予四神丸浸膏剂5 g/kg灌胃（大鼠给药剂量按照人和动物体型系数折算），SASP组给予SASP 0.3 g/kg灌胃，灌胃体积均为10 mL/kg，空白组和模型组灌服等体积生理盐水。各组于造模后第2日开始灌胃，每日1次，连续21 d。3周后处死，取标本。
2.3 取材
大鼠禁食24 h（不禁水）后，脱颈椎法处死大鼠，取血后迅速剖腹，取出距肛门以上8 cm处结肠段，沿肠系膜缘剪开肠腔，用冷PBS缓冲液冲洗肠内容物，肉眼观察各组大鼠肠组织大体形态情况记录并进行评分，取病变最明显处0.5 cm左右结肠组织，迅速移至液氮中保存，用于NF-κB p65 mRNA表达检测。
2.4 大体形态损伤评分
0分：无损伤；1分：充血但没有溃疡；2分：充血而且肠壁变厚但没有溃疡；3分：有一处小溃疡，直径约0～1 cm；4分：溃疡较大，直径1～2 cm，但肠管与外周脏器无粘连；5分：溃疡直径1～2 cm，肠管增厚，与周围脏器粘连严重。
2.5 免疫组织化学法检测核转录因子κB p65蛋白表达 采取经典的SABC法，将固定好的石蜡切片常规脱蜡至水。每张切片滴加3%H2O2，室温放置10 min。将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）中进行抗原热修复，自然冷却至室温，滴加5%BSA封闭液，室温20 min。分别滴加NF-κB p65一抗，4 ℃冰箱过夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37 ℃培养箱中孵育20 min。滴加试剂SABC，在37 ℃培养箱中孵育20 min。DAB显色剂，苏木素轻度复染3 min；经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在显微镜下观察结果，拍片。染色对照：同一组片中，用PBS代替一抗作孵育，其余步骤同上。
NF-κB p65蛋白主要表达于大鼠结肠组织中的肠道黏膜及黏膜下层，以胞浆为主。NF-κB p65表达阳性为胞质呈黄绿颗粒染色，颜色越深则表达越强，未出现黄绿颗粒者为阴性。采用BI-2000图像分析系统之免疫组化分析系统，随机选取5个视野，测阳性细胞平均灰度值，灰度值大，蛋白表达多，反之则表达少。
2.6 RT-PCR法检测核转录因子κB p65基因表达
总RNA的提取采用经典的Trizol法，应用Bio-RAd核酸定量分析仪测定总RNA的浓度和纯度，确保2.0>A260/A280>1.8。参照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，合成cDNA，用cDNA模板对大鼠内参照β-actin及NF-κB p65基因分别进行PCR扩增，引物由金唯智生物科技北京有限公司合成，内参照β-actin引物序列：上游引物为5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’，下游引物为5’-AAGGGTGTAAAACG CAGCTC-3’，扩增产物长度292 bp；NF-κB p65引物序列：上游引物为5’-GAGCAAGCCATTAGCCAGCG-3’，下游引物为5’-CACGGT TATCAAAAATCGGA-3’，产物长度173 bp。扩增反应体系为50 μL，其中cDNA 5 μL，上下游引物各1 μL，MgCl2 3 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP Mix 1 μL，Tap DNA聚合酶 0.25 μL，无酶水补足至50 μL。扩增参数为：预变性95 ℃、2 min，95 ℃变性45 s，退火52 ℃、45 s，72 ℃延伸30 s，共32个循环（β-actin为25个循环），总延伸72 ℃、5 min。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪上成像，采用Quantity One图像分析软件分析数据，获得各电泳条带的积分光密度（X），用β-actin的积分光密度（A）作为内参照，计算基因的相对表达量（X/A）作为实验数据。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间均数比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
模型组大鼠于造模当日开始出现稀便，觅食较不主动，食量减少，肛周污浊，于1周内体质量有所下降，毛色晦黯无光泽且被粪便沾染，持续稀便，部分大鼠有血便且肉眼可见；四神丸组、SASP组随着给药时间的持续，症状明显好转，大部分大鼠稀便症状消失，基本恢复正常，粪便呈灰褐色颗粒状，毛色逐渐转为光亮润泽，食量正常，活跃，体质量增长。
4.2 四神丸对大鼠结肠黏膜损伤的影响
模型组大鼠结肠黏膜可见明显的水肿、充血、溃疡，肠道缩短、肠壁变厚。经药物治疗后，大鼠结肠黏膜损伤情况均明显改善，其中四神丸组大鼠黏膜仅有少量的充血、水肿，其余损伤恢复正常，与模型组比较，四神丸组、SASP组评分明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。与SASP组比较，四神丸组结肠组织损伤情况恢复更好，但评分差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。
4.3 四神丸对大鼠结肠黏膜核转录因子κB p65蛋白表达的影响
免疫组化NF-κB p65显示，空白组NF-κB p65蛋白少量表达，模型组NF-κB p65蛋白表达较多，阳性细胞数量较多；SASP组NF-κB p65蛋白表达较弱，数量较少，四神丸组NF-κB p65蛋白表达较弱，阳性细胞数量较少，与SASP组比较无明显差异。结果见表1、图1。
5 讨论
中医认为，UC的发生是由于情志损伤、饮食、劳倦等多种因素相互作用导致五脏失调引起[6]。由于本病病程多数较长，其发生虽与饮食伤脾十分相关，但“五脏所伤、穷必及肾”，所以UC发病日久易致肾虚。又因肾主二便，肾虚则气化不行，大便失约而为泄泻，故临床治疗从“脾虚泄泻”、“肾虚泄泻”论治UC是重要思路。
NF-κB是一种能与多种基因启动子或增强子部位κB位点发生特异性结合并促进其相关基因转录的蛋白质因子，参与调节多种炎症和免疫基因的表达调控[7]。NF-κB广泛存在于各种组织中，在免疫和炎症反应、细胞生长、病毒感染及某些疾病急性期反应等方面起着重要作用。有功能活性的NF-κB二聚体大都含p65亚单位，这样的二聚体具有显著的促炎活性[8]。含p65的NF-κB二聚体的激活，可能是UC中炎症因子分泌的重要调控者。NF-κB p65是UC细胞因子释放的关键调控因素，在UC的发生和发展中起着十分重要的作用[9]。NF-κB p65在UC中可能的致病作用是NF-κB p65被活化后，直接调节一系列炎症细胞因子等的转录和蛋白质合成，导致这些炎症递质产量增高，引起结肠黏膜损伤[10]。另外，当炎症因子反作用于NF-κB信号通路时，导致更多的NF-κB蛋白转移到核内，调控多种炎症因子相关基因的表达，进一步使肠道炎症反应加重，所以，如果能阻止NF-κB信号通路开放，就可能十分有效地治疗肠道炎症[11-12]。
本研究结果表明，空白组大鼠结肠组织NF-κB p65基因和蛋白表达下调，模型组大鼠结肠黏膜NF-κB p65基因和蛋白表达量上调，说明在UC发病时，NF-κB信号通路可能已被激活。而治疗组NF-κB p65基因和蛋白表达又明显下调，说明四神丸可能具有防止NF-κB信号通路开放的作用。实验结果还显示，NF-κB p65基因和蛋白表达量与结肠黏膜组织的损伤程度一致。上述研究结果表明，NF-κB p65信号通路的激活可能参与了UC的发病，四神丸治疗UC的疗效机制可能是发挥“温肾健脾”的整体调节作用，激活了NF-κB p65的效用，其具体作用机制可能是通过降低NF-κB p65 mRNA转录水平，调控NF-κB p65蛋白的表水平，发挥抑制NF-κB p65合成的作用，使NF-κB p65蛋白表达水平降低，一方面可能通过抑制阻止NF-κB信号通路的开放而发挥其在UC中的抗炎作用，也可能是通过调控NF-κB的活化，抑制多种炎症细胞因子的释放和表达而发挥抗炎作用，其相关作用机理有待进一步研究。 参考文献：
[1] 路晓红，杨恩来，赵霞，等.溃疡性结肠炎免疫机制的研究进展[J].山西中医学院学报，2011，12（1）：66-69.
[2] 陈治水，陈宁.溃疡性结肠炎中西医结合研究新进展[J].中国中西医结合杂志，2012，32（4）：437-442.
[3] 徐晓云，李冬斌，李彬.TLR4、NF-κBp65、IL-8在溃疡性结肠炎中的表达[J].疑难病杂志，2012，11（3）：181-182.
[4] 朱向东，梅晓云，王燕.痛泻要方对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜PPAR-γ基因和蛋白表达的影响[J].中华中医药杂志，2013，28（4）：941-945.
[5] 朱向东，梅晓云，吴红彦，等.痛泻要方对溃疡性结肠炎大鼠结肠黏膜细胞间黏附分子-1mRNA 和蛋白表达的影响[J].中国实验方剂学杂志， 2013，19（6）：174-178.
[6] 路晓红，杨恩来，赵霞，等.溃疡性结肠炎免疫机制的研究进展[J].山西中医学院学报，2011，12（1）：66-68.
[7] 邓辉，钦丹萍.中医药对溃疡性结肠炎细胞因子的干预研究[J].中国中西医结合消化杂志，2006，14（5）：344-346.
[8] Li Z， Zhang DK， Yi WQ， et al. NF-kappaB p65 antisense oligonucleotides may serve as a novel molecular approach for the treatment of patients with ulcerative colitis[J]. Arch Med Res， 2008，39（8）：729-734.
[9] 何雁，王志红，杨善峰，等.TLR9和NF-κB p65在大鼠溃疡性结肠炎模型结肠组织中的表达[J].安徽医药，2012，16（7）：938-940.
[10] 荣英蕊，刘建平，陈建权，等.泄浊解毒方对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织NF-κB p65及ICAM-1表达的影响[J].上海中医药杂志，2010，44（3）：63-65.
[11] 赖远全，孙燕，余琴，等.核因子-κB在结肠炎的表达及地塞米松对其影响[J].实用医学杂志，2004，20（4）：365-367.
[12] 朱向东，李兰珍，段永强.痛泻要方对溃疡性结肠炎大鼠结肠组织病理形态及血清中相关因子含量的影响[J].中国中医药信息杂志，2013， 20（4）：41-43.
（收稿日期：2013-06-17，编辑：华强）
关键词：四神丸；溃疡性结肠炎；核转录因子κB p65；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0049-04
溃疡性结肠炎（ulcerative colitis，UC）是一种主要累及直肠、结肠黏膜的慢性非特异性炎症，临床以腹痛、腹泻、黏液脓血便为特征。目前其病因和发病机制尚不十分明确，该病复发率高，且缠绵难愈，有发生癌变的可能性，临床上缺乏特异性治疗药物[1-2]。核转录因子（NF）-κB是一种多功能核转录因子，具有广泛的生物学活性，在机体免疫炎症反应中起着重要作用[3]。现有研究显示，NF-κB p65在UC的发生发展中，作为一种重要的转录因子，是多种信号途径的汇聚点，在调节炎性反应的基因中起着关键作用[3]，但对于NF-κB p65在UC肠道炎症中的具体作用机制还需要进一步探讨。本实验在前期工作的基础上，进一步观察四神丸对UC模型大鼠结肠黏膜NF-κB p65蛋白和基因表达的影响，以期探讨四神丸治疗UC的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
采用SPF级Wistar大鼠40只，体质量（180±10）g，雌雄各半，甘肃中医学院科研实验动物中心提供，动物许可证号：SYXK（甘）2004-0006。
1.2 试剂
Trizol试剂（批号19919）、琼脂糖（批号0000101394）均购自Invitrogen公司；2，4，6-三硝基苯磺酸（TNBS）：美国Sigma公司生产，批号2008162；反转录试剂盒（批号0000007526）、PCR试剂盒（批号108030404）均购自Promega Corporation。一抗NF-κB p65、SP免疫组化染色试剂盒、DAB染色试剂盒（北京博奥森生物工程开发有限公司产品）。
1.3 仪器
美国BIO-RAD凝胶成像仪、电泳槽、电泳仪，美国BIO-RAD S1000TM型PCR仪，德国3-16PK型通用台式高速离心机，海尔DM-86L626型立式超低温冰箱，美国Bio-RAd核酸定量分析仪，成都太盟BI-2000图像分析系统之免疫组化分析系统。
1.4 药物
四神丸由甘肃中医学院附属医院药剂室制备。按照《证治准绳》原方2∶4∶2∶1∶2比例取肉豆蔻、补骨脂、五味子、吴茱萸、大枣，用8倍量70%的乙醇每次回流2 h，提取3次，得醇提取液和醇提取药渣。合并3次醇提取液，滤过，滤液减压回收乙醇后得醇提取浓缩液，醇提取浓缩液干燥得干膏，干膏粉碎成细粉，加入挥发油。实验用不含赋形剂的浸膏，4 ℃冰箱保存备用。柳氮磺吡啶（SASP）每片0.25 g，上海三维制药有限公司生产，国药准字H31020450。
2 实验方法
2.1 造模
参考文献[4-5]，采用TNBS/乙醇溶液灌肠法制作UC大鼠模型。将Wistar大鼠40只，禁食（不禁水）24 h，用10%水合氯醛腹腔麻醉（0.3 mL/100 g）后，一次性将TNBS/乙醇液（100 mg/kg TNBS+50%乙醇0.25 mL）溶液用橡胶输液管轻缓注入大鼠距肛门约7～8 cm深的肠腔内，留置数分钟。然后用针头抽取一定量的空气，同样方法注入大鼠肠腔，防止溶液外漏，让动物保持平躺状态，自然清醒。空白组大鼠采用同样方法等量生理盐水灌肠。
2.2 分组与给药
将实验动物分为空白组、模型组、四神丸组和SASP组，每组10只。除空白组外，均以100 mg/kg TNBS加50%乙醇0.25 mL混合试剂灌肠。四神丸组均给予四神丸浸膏剂5 g/kg灌胃（大鼠给药剂量按照人和动物体型系数折算），SASP组给予SASP 0.3 g/kg灌胃，灌胃体积均为10 mL/kg，空白组和模型组灌服等体积生理盐水。各组于造模后第2日开始灌胃，每日1次，连续21 d。3周后处死，取标本。
2.3 取材
大鼠禁食24 h（不禁水）后，脱颈椎法处死大鼠，取血后迅速剖腹，取出距肛门以上8 cm处结肠段，沿肠系膜缘剪开肠腔，用冷PBS缓冲液冲洗肠内容物，肉眼观察各组大鼠肠组织大体形态情况记录并进行评分，取病变最明显处0.5 cm左右结肠组织，迅速移至液氮中保存，用于NF-κB p65 mRNA表达检测。
2.4 大体形态损伤评分
0分：无损伤；1分：充血但没有溃疡；2分：充血而且肠壁变厚但没有溃疡；3分：有一处小溃疡，直径约0～1 cm；4分：溃疡较大，直径1～2 cm，但肠管与外周脏器无粘连；5分：溃疡直径1～2 cm，肠管增厚，与周围脏器粘连严重。
2.5 免疫组织化学法检测核转录因子κB p65蛋白表达 采取经典的SABC法，将固定好的石蜡切片常规脱蜡至水。每张切片滴加3%H2O2，室温放置10 min。将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液（pH 6.0）中进行抗原热修复，自然冷却至室温，滴加5%BSA封闭液，室温20 min。分别滴加NF-κB p65一抗，4 ℃冰箱过夜。滴加生物素化山羊抗兔IgG，在37 ℃培养箱中孵育20 min。滴加试剂SABC，在37 ℃培养箱中孵育20 min。DAB显色剂，苏木素轻度复染3 min；经梯度乙醇脱水，二甲苯透明，中性树胶封片。在显微镜下观察结果，拍片。染色对照：同一组片中，用PBS代替一抗作孵育，其余步骤同上。
NF-κB p65蛋白主要表达于大鼠结肠组织中的肠道黏膜及黏膜下层，以胞浆为主。NF-κB p65表达阳性为胞质呈黄绿颗粒染色，颜色越深则表达越强，未出现黄绿颗粒者为阴性。采用BI-2000图像分析系统之免疫组化分析系统，随机选取5个视野，测阳性细胞平均灰度值，灰度值大，蛋白表达多，反之则表达少。
2.6 RT-PCR法检测核转录因子κB p65基因表达
总RNA的提取采用经典的Trizol法，应用Bio-RAd核酸定量分析仪测定总RNA的浓度和纯度，确保2.0>A260/A280>1.8。参照逆转录试剂盒说明书进行逆转录，合成cDNA，用cDNA模板对大鼠内参照β-actin及NF-κB p65基因分别进行PCR扩增，引物由金唯智生物科技北京有限公司合成，内参照β-actin引物序列：上游引物为5’-CCTCTATGCCAACACAGTGC-3’，下游引物为5’-AAGGGTGTAAAACG CAGCTC-3’，扩增产物长度292 bp；NF-κB p65引物序列：上游引物为5’-GAGCAAGCCATTAGCCAGCG-3’，下游引物为5’-CACGGT TATCAAAAATCGGA-3’，产物长度173 bp。扩增反应体系为50 μL，其中cDNA 5 μL，上下游引物各1 μL，MgCl2 3 μL，10×Reaction Buffer 5 μL，dNTP Mix 1 μL，Tap DNA聚合酶 0.25 μL，无酶水补足至50 μL。扩增参数为：预变性95 ℃、2 min，95 ℃变性45 s，退火52 ℃、45 s，72 ℃延伸30 s，共32个循环（β-actin为25个循环），总延伸72 ℃、5 min。PCR扩增产物于1%琼脂糖凝胶中电泳，在凝胶成像仪上成像，采用Quantity One图像分析软件分析数据，获得各电泳条带的积分光密度（X），用β-actin的积分光密度（A）作为内参照，计算基因的相对表达量（X/A）作为实验数据。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。实验数据以—x±s表示，组间均数比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 一般情况
模型组大鼠于造模当日开始出现稀便，觅食较不主动，食量减少，肛周污浊，于1周内体质量有所下降，毛色晦黯无光泽且被粪便沾染，持续稀便，部分大鼠有血便且肉眼可见；四神丸组、SASP组随着给药时间的持续，症状明显好转，大部分大鼠稀便症状消失，基本恢复正常，粪便呈灰褐色颗粒状，毛色逐渐转为光亮润泽，食量正常，活跃，体质量增长。
4.2 四神丸对大鼠结肠黏膜损伤的影响
模型组大鼠结肠黏膜可见明显的水肿、充血、溃疡，肠道缩短、肠壁变厚。经药物治疗后，大鼠结肠黏膜损伤情况均明显改善，其中四神丸组大鼠黏膜仅有少量的充血、水肿，其余损伤恢复正常，与模型组比较，四神丸组、SASP组评分明显降低，差异有统计学意义（P<0.01）。与SASP组比较，四神丸组结肠组织损伤情况恢复更好，但评分差异无统计学意义（P>0.05）。结果见表1。
4.3 四神丸对大鼠结肠黏膜核转录因子κB p65蛋白表达的影响
免疫组化NF-κB p65显示，空白组NF-κB p65蛋白少量表达，模型组NF-κB p65蛋白表达较多，阳性细胞数量较多；SASP组NF-κB p65蛋白表达较弱，数量较少，四神丸组NF-κB p65蛋白表达较弱，阳性细胞数量较少，与SASP组比较无明显差异。结果见表1、图1。
5 讨论
中医认为，UC的发生是由于情志损伤、饮食、劳倦等多种因素相互作用导致五脏失调引起[6]。由于本病病程多数较长，其发生虽与饮食伤脾十分相关，但“五脏所伤、穷必及肾”，所以UC发病日久易致肾虚。又因肾主二便，肾虚则气化不行，大便失约而为泄泻，故临床治疗从“脾虚泄泻”、“肾虚泄泻”论治UC是重要思路。
NF-κB是一种能与多种基因启动子或增强子部位κB位点发生特异性结合并促进其相关基因转录的蛋白质因子，参与调节多种炎症和免疫基因的表达调控[7]。NF-κB广泛存在于各种组织中，在免疫和炎症反应、细胞生长、病毒感染及某些疾病急性期反应等方面起着重要作用。有功能活性的NF-κB二聚体大都含p65亚单位，这样的二聚体具有显著的促炎活性[8]。含p65的NF-κB二聚体的激活，可能是UC中炎症因子分泌的重要调控者。NF-κB p65是UC细胞因子释放的关键调控因素，在UC的发生和发展中起着十分重要的作用[9]。NF-κB p65在UC中可能的致病作用是NF-κB p65被活化后，直接调节一系列炎症细胞因子等的转录和蛋白质合成，导致这些炎症递质产量增高，引起结肠黏膜损伤[10]。另外，当炎症因子反作用于NF-κB信号通路时，导致更多的NF-κB蛋白转移到核内，调控多种炎症因子相关基因的表达，进一步使肠道炎症反应加重，所以，如果能阻止NF-κB信号通路开放，就可能十分有效地治疗肠道炎症[11-12]。
本研究结果表明，空白组大鼠结肠组织NF-κB p65基因和蛋白表达下调，模型组大鼠结肠黏膜NF-κB p65基因和蛋白表达量上调，说明在UC发病时，NF-κB信号通路可能已被激活。而治疗组NF-κB p65基因和蛋白表达又明显下调，说明四神丸可能具有防止NF-κB信号通路开放的作用。实验结果还显示，NF-κB p65基因和蛋白表达量与结肠黏膜组织的损伤程度一致。上述研究结果表明，NF-κB p65信号通路的激活可能参与了UC的发病，四神丸治疗UC的疗效机制可能是发挥“温肾健脾”的整体调节作用，激活了NF-κB p65的效用，其具体作用机制可能是通过降低NF-κB p65 mRNA转录水平，调控NF-κB p65蛋白的表水平，发挥抑制NF-κB p65合成的作用，使NF-κB p65蛋白表达水平降低，一方面可能通过抑制阻止NF-κB信号通路的开放而发挥其在UC中的抗炎作用，也可能是通过调控NF-κB的活化，抑制多种炎症细胞因子的释放和表达而发挥抗炎作用，其相关作用机理有待进一步研究。 参考文献：
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（收稿日期：2013-06-17，编辑：华强）