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摘要：目的 建立中药注射剂工艺中活性炭去除热原效果的评价方法。方法 以动态浊度法，测定中药注射剂浓配药液中活性炭使用前后细菌内毒素的含量，评价其去除热原的效果。结果 在双黄连粉针剂和注射用丹参（冻干）2种粉针剂浓配药液的活性炭使用效果的评价中，双黄连药液中的吸附率≥70%，丹参药液中的吸附率>95%。结论 中药粉针剂在制造过程中加入活性炭吸附大量热原是合理的。但对于大剂量的细菌内毒素，活性炭不能完全吸附去除。
关键词：热原；活性炭；中药注射剂；双黄连粉针剂；注射用丹参（冻干）
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0080-03
热原又称内毒素，注入人体的注射剂中含有热原量达1 μg/kg就可引起不良反应，如发热反应通常在注入1 h后出现，有时体温可升至40 ℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命[1]。该现象称为“热原反应”。因此，国家食品药品监督管理局在《中药注射剂安全性再评价生产工艺评价技术原则（试行）》中指出“生产工艺过程中应明确除热原（或细菌内毒素）的方法及条件，如活性炭的用量、处理方法、加入时机、加热温度及时间等，并考察除热原效果及对药物成份的影响。应提供相关研究资料”。因此，建立一种生产工艺过程中的热原去除效果评价方法，用以评价中药注射剂现有除热原工艺和新药研制过程设计的除热原工艺的合理性与科学性。
1 仪器与试药
BET-72细菌内毒素测定仪（天津天大天发科技有限公司）；ZH-2 BLENDER漩涡混合器（天津药典标准仪器厂）。
732型针用活性炭（180 ℃活化4 h），批号090901，浙江杭木工业有限公司活性炭分公司；定量检测鲎试剂，规格0.03 Eu，批号1002260，湛江博康海洋生物有限公司；细菌内毒素检查用水，内毒素含量<0.015 Eu/mL，批号09090402，福州新北生化工业有限公司；细菌内毒素工作标准品，规格：180 Eu/支，批号150601-200965，中国药品生物制品检定所；自制热原（大肠杆菌培养液处理）规格>50 000 Eu/mL；一次性注射器，规格1 mL，批号080927，上海康寿医疗器械有限公司；注射器过滤器（无菌无热原滤器），批号081117-051，JET BIOFIL?提供；双黄连粉针剂浓配药液、注射用丹参（冻干）浓配药液均由哈药集团中药二厂粉针制剂车间提供。
2 方法与结果
2.1 水中除热原效果试验
取注射用水45 mL，加5 mL自制热原，取1 mL作为对照，其余加0.25 g活性炭，加热至微沸，保持15 min，过滤，取1 mL滤过液作为试验样品溶液。对照溶液梯度稀释（10倍、下同），2个浓度1/1000和1/10 000分别取0.1 mL，加0.1 mL鲎试剂，仪器测定。供试品溶液分别取原液和1/10浓度0.1 mL，加0.1 mL鲎试剂，仪器测定。重复试验3次。
2.2 浓配药液中除热原效果试验
取双黄连粉针或注射用丹参（冻干）浓配药液40 mL，加10 mL自制热原，取1 mL作为对照样品，其余加0.25 g （0.5%）活性炭，加热至微沸，保持15 min，过滤，取1 mL滤过液作为试验样品溶液。对照样品溶液梯度稀释（10倍，下同），3个浓度（1/100、1/1000、1/10 000）分别取0.1 mL，加0.1 mL鲎试剂，仪器测定。试验样品溶液梯度稀释，3个浓度（1/100、1/1000和1/10 000）分别取0.1 mL，加0.1 mL鲎试剂，仪器测定[2-3]。重复试验3次。
2.3 内毒素含量测定
2.3.1 细菌内毒素标准曲线的制备 取细菌内毒素工作标准品1支，用BET水将内毒素进行2倍稀释，使其最终浓度分别为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 Eu/mL的稀释系列，各取0.1 mL分别加到预先加有0.1 mL 鲎试剂的反应管内，混合均匀，插入BET-72细菌内毒素测定系统内进行检测，每个浓度重复3管。标准曲线回归方程为：lgT=2.97976-0.24834lgC，r=0.9956（>0.98），且空白对照管的平均反应时间>3000 s在检测时间外，因此标准曲线成立[4]。
2.3.2 动态比浊法干扰试验 以样品的添加内毒素平均回收率来判断，若回收率在50%～200%范围内，表明样品溶液对鲎试剂反应无干扰影响。双黄连粉针剂以及注射用丹参冻干浓配药液在最小稀释倍数稀释100倍的条件下，样品没有干扰。
2.4 评价方法
以最终内毒素量下降倍数的对数值来判断其有效性，美国药典与欧洲药典分别以下降3个与4个对数（3log与4log）为有效，参照上述标准，该方案的评价指标为：设备在空载加水运行状态，热原去除倍数的log值≥4，设备负载加药液运行状态，热原去除倍数的log值≥3。如达不到上述评价指标则计算内毒素吸附率，明确活性炭在中药注射剂制备工艺中应用的合理性，明确活性炭在中药浓配药液中是否有吸附热原的作用。结果见表1、表2。
结果表明，在水中活性炭对细菌内毒素的去除效果可达到log值3.8，符合美国药典有关细菌内毒素的去除效果，但不符合欧洲药典的相关规定，说明活性炭对于去除热原确实有效[5]，同时证明活性炭能够吸附双黄连粉针剂浓配药液和注射用丹参浓配药液中热原，其中双黄连药液中吸附率≥70%，而丹参药液中吸附率>95%。但大剂量细菌内毒素污染的情况下不能彻底去除，提示单纯仅使用活性炭作为去除热原的方法时，药品的临床应用存在较大的安全性风险。
3 讨论
中药注射剂大多数是20世纪七八十年代开始在临床使用，当时中药注射剂的除热原工艺基本上只用活性炭，而且很多注射剂活性炭处理至今都是不可缺少的关键工艺。中药粉针剂的浓配药液中固体物超过20%，按照批准工艺[2-3]的0.5%活性炭用量能否彻底去除热原受到业界质疑。安全性再评价有明确要求进行相关研究，因此设计上述大剂量热原挑战性评价方案。由于液体中热原去除效果没有明确的评价指标，我们采用的是干热烘箱或者隧道高温（180 ℃以上）杀灭的验证评价指标，指标是彻底去除较为严格，故又设计内毒素吸附率作为参考指标。结果说明粉针剂在制造过程中加入活性炭吸附热原（细菌内毒素）具有合理性，但对于大剂量的细菌内毒素，活性炭不能完全吸附去除[6]。另外用文中方法评价了本研究中2种粉针剂工艺中应用的超滤工艺[7]，结果超滤单独使用细菌内毒素的去除效果log值均>3。进一步提示中药注射剂在生产过程中和研制设计中应采用活性炭以外的其他除热原工艺（例如超滤工艺）或者联用。建议研制和设计中药注射剂除热原工艺时，一定要进行挑战性评价，避免由于工艺设计的缺陷将来蒙受巨额损失。 通过试验研究认为，细菌内毒素含量测定方法动态比浊法，对于以水为检测介质时，不同稀释倍数对含量影响相对较小，但是以浓配药液为介质时，不同的稀释倍数对结果有一定的影响，因此建议在相同稀释倍数即相同浓度药液的样品平行比较，这样可认为对鲎试剂凝胶反应速度的影响一致。通过对试验过程中不同稀释倍数的样品检测，相同稀释倍数的样品活性炭处理前后细菌内毒素的去除百分比基本一致。
内毒素的含量测定方法较多[8]，我们采用方法的原理是根据内毒素与鲎试剂的C因子发生反应，由内毒素引发激活的凝固酶，切断凝固蛋白原的精氨酸肽链，形成凝固蛋白，从而产生凝胶过程中的浊度变化，是用浊度仪定量的方法，此法操作比较简单、经济、灵敏度较高、检测范围较大（0.006～300 Eu/mL）。但针对中药注射剂成分复杂，浓溶液一般都有干扰，需要进行稀释之后才能检测，本试验中的2种注射剂浓溶液均抑制鲎试剂凝胶形成，1000 Eu仍呈现假阴性，稀释100倍后符合检验要求，文中鲎试剂灵敏度为0.03 Eu/mL，但药液的检测限也只有3 Eu/mL，要获得较高的检测限仍需对方法进行改进，或者采用其他检测方法均有待于进一步深入研究。
参考文献：
[1] 岳振华，崔茂杰.关于注射剂热原控制的探讨[J].齐鲁药事，2012， 31（9）：548-549.
[2] 国家食品药品监督管理局.国家药品标准[S].注射用丹参WS3-320 （Z-40）-2003（Z）.
[3] 中华人民共和国卫生部.WS3-183（Z-033）-98（Z）卫生部药品标准：双黄连粉针剂[S].1998.
[4] 祝清芬，国明，魏霞，等.米力农注射液动态浊度法细菌内毒素检查方法研究[J].中国新药杂志，2013，22（3）：355-358.
[5] 范能全.活性炭去除注射液中热原的工艺条件考察[J].中国药师， 2012，15（9）：1301-1305.
[6] 李贺敏，郑云枫，支兴蕾，等.活血通络注射剂活性炭法与超滤法工艺比较[J].中药材，2012，35（12）：2012-2015.
[7] 崔仁海，李文春，李长新，等.一种中药注射剂中热原去除工艺的评价方法：中国，201310209207.5[P].2013-05-30.
[8] 杨忠思，吴振军，杜滨.热原和细菌内毒素检查研究进展[J].医学综述，2005，11（2）：142-144.
（收稿日期：2013-07-12，编辑：陈静）
关键词：热原；活性炭；中药注射剂；双黄连粉针剂；注射用丹参（冻干）
中图分类号：R283.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）02-0080-03
热原又称内毒素，注入人体的注射剂中含有热原量达1 μg/kg就可引起不良反应，如发热反应通常在注入1 h后出现，有时体温可升至40 ℃以上，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命[1]。该现象称为“热原反应”。因此，国家食品药品监督管理局在《中药注射剂安全性再评价生产工艺评价技术原则（试行）》中指出“生产工艺过程中应明确除热原（或细菌内毒素）的方法及条件，如活性炭的用量、处理方法、加入时机、加热温度及时间等，并考察除热原效果及对药物成份的影响。应提供相关研究资料”。因此，建立一种生产工艺过程中的热原去除效果评价方法，用以评价中药注射剂现有除热原工艺和新药研制过程设计的除热原工艺的合理性与科学性。
1 仪器与试药
BET-72细菌内毒素测定仪（天津天大天发科技有限公司）；ZH-2 BLENDER漩涡混合器（天津药典标准仪器厂）。
732型针用活性炭（180 ℃活化4 h），批号090901，浙江杭木工业有限公司活性炭分公司；定量检测鲎试剂，规格0.03 Eu，批号1002260，湛江博康海洋生物有限公司；细菌内毒素检查用水，内毒素含量<0.015 Eu/mL，批号09090402，福州新北生化工业有限公司；细菌内毒素工作标准品，规格：180 Eu/支，批号150601-200965，中国药品生物制品检定所；自制热原（大肠杆菌培养液处理）规格>50 000 Eu/mL；一次性注射器，规格1 mL，批号080927，上海康寿医疗器械有限公司；注射器过滤器（无菌无热原滤器），批号081117-051，JET BIOFIL?提供；双黄连粉针剂浓配药液、注射用丹参（冻干）浓配药液均由哈药集团中药二厂粉针制剂车间提供。
2 方法与结果
2.1 水中除热原效果试验
取注射用水45 mL，加5 mL自制热原，取1 mL作为对照，其余加0.25 g活性炭，加热至微沸，保持15 min，过滤，取1 mL滤过液作为试验样品溶液。对照溶液梯度稀释（10倍、下同），2个浓度1/1000和1/10 000分别取0.1 mL，加0.1 mL鲎试剂，仪器测定。供试品溶液分别取原液和1/10浓度0.1 mL，加0.1 mL鲎试剂，仪器测定。重复试验3次。
2.2 浓配药液中除热原效果试验
取双黄连粉针或注射用丹参（冻干）浓配药液40 mL，加10 mL自制热原，取1 mL作为对照样品，其余加0.25 g （0.5%）活性炭，加热至微沸，保持15 min，过滤，取1 mL滤过液作为试验样品溶液。对照样品溶液梯度稀释（10倍，下同），3个浓度（1/100、1/1000、1/10 000）分别取0.1 mL，加0.1 mL鲎试剂，仪器测定。试验样品溶液梯度稀释，3个浓度（1/100、1/1000和1/10 000）分别取0.1 mL，加0.1 mL鲎试剂，仪器测定[2-3]。重复试验3次。
2.3 内毒素含量测定
2.3.1 细菌内毒素标准曲线的制备 取细菌内毒素工作标准品1支，用BET水将内毒素进行2倍稀释，使其最终浓度分别为2.0、1.0、0.5、0.25、0.125 Eu/mL的稀释系列，各取0.1 mL分别加到预先加有0.1 mL 鲎试剂的反应管内，混合均匀，插入BET-72细菌内毒素测定系统内进行检测，每个浓度重复3管。标准曲线回归方程为：lgT=2.97976-0.24834lgC，r=0.9956（>0.98），且空白对照管的平均反应时间>3000 s在检测时间外，因此标准曲线成立[4]。
2.3.2 动态比浊法干扰试验 以样品的添加内毒素平均回收率来判断，若回收率在50%～200%范围内，表明样品溶液对鲎试剂反应无干扰影响。双黄连粉针剂以及注射用丹参冻干浓配药液在最小稀释倍数稀释100倍的条件下，样品没有干扰。
2.4 评价方法
以最终内毒素量下降倍数的对数值来判断其有效性，美国药典与欧洲药典分别以下降3个与4个对数（3log与4log）为有效，参照上述标准，该方案的评价指标为：设备在空载加水运行状态，热原去除倍数的log值≥4，设备负载加药液运行状态，热原去除倍数的log值≥3。如达不到上述评价指标则计算内毒素吸附率，明确活性炭在中药注射剂制备工艺中应用的合理性，明确活性炭在中药浓配药液中是否有吸附热原的作用。结果见表1、表2。
结果表明，在水中活性炭对细菌内毒素的去除效果可达到log值3.8，符合美国药典有关细菌内毒素的去除效果，但不符合欧洲药典的相关规定，说明活性炭对于去除热原确实有效[5]，同时证明活性炭能够吸附双黄连粉针剂浓配药液和注射用丹参浓配药液中热原，其中双黄连药液中吸附率≥70%，而丹参药液中吸附率>95%。但大剂量细菌内毒素污染的情况下不能彻底去除，提示单纯仅使用活性炭作为去除热原的方法时，药品的临床应用存在较大的安全性风险。
3 讨论
中药注射剂大多数是20世纪七八十年代开始在临床使用，当时中药注射剂的除热原工艺基本上只用活性炭，而且很多注射剂活性炭处理至今都是不可缺少的关键工艺。中药粉针剂的浓配药液中固体物超过20%，按照批准工艺[2-3]的0.5%活性炭用量能否彻底去除热原受到业界质疑。安全性再评价有明确要求进行相关研究，因此设计上述大剂量热原挑战性评价方案。由于液体中热原去除效果没有明确的评价指标，我们采用的是干热烘箱或者隧道高温（180 ℃以上）杀灭的验证评价指标，指标是彻底去除较为严格，故又设计内毒素吸附率作为参考指标。结果说明粉针剂在制造过程中加入活性炭吸附热原（细菌内毒素）具有合理性，但对于大剂量的细菌内毒素，活性炭不能完全吸附去除[6]。另外用文中方法评价了本研究中2种粉针剂工艺中应用的超滤工艺[7]，结果超滤单独使用细菌内毒素的去除效果log值均>3。进一步提示中药注射剂在生产过程中和研制设计中应采用活性炭以外的其他除热原工艺（例如超滤工艺）或者联用。建议研制和设计中药注射剂除热原工艺时，一定要进行挑战性评价，避免由于工艺设计的缺陷将来蒙受巨额损失。 通过试验研究认为，细菌内毒素含量测定方法动态比浊法，对于以水为检测介质时，不同稀释倍数对含量影响相对较小，但是以浓配药液为介质时，不同的稀释倍数对结果有一定的影响，因此建议在相同稀释倍数即相同浓度药液的样品平行比较，这样可认为对鲎试剂凝胶反应速度的影响一致。通过对试验过程中不同稀释倍数的样品检测，相同稀释倍数的样品活性炭处理前后细菌内毒素的去除百分比基本一致。
内毒素的含量测定方法较多[8]，我们采用方法的原理是根据内毒素与鲎试剂的C因子发生反应，由内毒素引发激活的凝固酶，切断凝固蛋白原的精氨酸肽链，形成凝固蛋白，从而产生凝胶过程中的浊度变化，是用浊度仪定量的方法，此法操作比较简单、经济、灵敏度较高、检测范围较大（0.006～300 Eu/mL）。但针对中药注射剂成分复杂，浓溶液一般都有干扰，需要进行稀释之后才能检测，本试验中的2种注射剂浓溶液均抑制鲎试剂凝胶形成，1000 Eu仍呈现假阴性，稀释100倍后符合检验要求，文中鲎试剂灵敏度为0.03 Eu/mL，但药液的检测限也只有3 Eu/mL，要获得较高的检测限仍需对方法进行改进，或者采用其他检测方法均有待于进一步深入研究。
参考文献：
[1] 岳振华，崔茂杰.关于注射剂热原控制的探讨[J].齐鲁药事，2012， 31（9）：548-549.
[2] 国家食品药品监督管理局.国家药品标准[S].注射用丹参WS3-320 （Z-40）-2003（Z）.
[3] 中华人民共和国卫生部.WS3-183（Z-033）-98（Z）卫生部药品标准：双黄连粉针剂[S].1998.
[4] 祝清芬，国明，魏霞，等.米力农注射液动态浊度法细菌内毒素检查方法研究[J].中国新药杂志，2013，22（3）：355-358.
[5] 范能全.活性炭去除注射液中热原的工艺条件考察[J].中国药师， 2012，15（9）：1301-1305.
[6] 李贺敏，郑云枫，支兴蕾，等.活血通络注射剂活性炭法与超滤法工艺比较[J].中药材，2012，35（12）：2012-2015.
[7] 崔仁海，李文春，李长新，等.一种中药注射剂中热原去除工艺的评价方法：中国，201310209207.5[P].2013-05-30.
[8] 杨忠思，吴振军，杜滨.热原和细菌内毒素检查研究进展[J].医学综述，2005，11（2）：142-144.
（收稿日期：2013-07-12，编辑：陈静）