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摘 要：该研究探讨了不同培养条件对Ceriporiopsis subvermispora NL-4固态发酵产漆酶的影响。结果表明，当培养温度为30℃、培养基的初始含水率为64%、接种量为12%、起始pH 6.0时，该菌株活力最好且漆酶产量高；在条件下培养10d，漆酶活力可达12.45 U/g干基，比优化前提高了40%。
关键词：虫拟蜡菌；固态发酵；漆酶
中图分类号 TQ925 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）08-0018-03
Abstract：Effect of culture conditions for the production of laccase by Ceriporiopsis subvermispora NL-4 were investigated in solid-state fermentation using the milled bamboo as main substrate.The results of single-factor test showed that the optimal culture conditions of the temperature，moisture of medium，inoulum volume and the initial pH were 30℃，64%，12% and 6.0.After the strain of C. subvermispora NL-4 was cultured for 10d growth under the conditions of the above parameters，the laccase activity was up to 12.45U/g dry medium，which was 40% higher than that under the primitive conditions.
Key words：Ceriporiopsis subvermispor；Solid-fermentation；Laccase
漆酶（laccase，p-diphenoloxidase，E.C.1.10.3.2）最初是從漆树中获得的，随着生物技术的发展，微生物源漆酶有了较大的发展。由于漆酶在多个领域具有广泛的用途，对漆酶的需求日益增多[1-2]。但目前微生物产漆酶的产量仍不高[3]，培养期过长导致染菌的可能性增大；漆酶的产量过低严重制约了其分离提取和纯化[4]。采用农林生物质资源作为主要基质，通过固态培养的方式探索漆酶的产生及其产量的提高，不但可以有效节约资源，降低生产成本，减少污染物的排放[5]；同时，与液体发酵相比，固态发酵更接近于自然界的生态环境，有利于菌株产酶[6-7]。虫拟蜡菌（Ceriporiopsis subvermispor）[8]是一类高产漆酶的白腐菌，本研究室对其进行了菌株的诱变，获得了一株漆酶产量明显提高的菌株C. subvermispora NL-4[9]。因此，本研究以Ceriporiopsis subvermispora NL-4为发酵菌株，以竹粉为主要基质，对该菌固态发酵产漆酶的条件进行优化，以提高漆酶产量和产酶效率[10]。
1 材料与方法
1.1 菌株 C. subvermispora NL-4，本研究室诱变选育获得。
1.2 竹粉 竹粉，为毛竹（Phyllostachys pubescens）的加工剩余物，产自浙江临安，烘干后过40目筛，干燥贮存备用。
1.3 试剂 葡萄糖等均为国产分析纯，购自杭州木木生物科技有限公司；ABTS，购于sigma公司；马铃薯等购于临安浙皖农贸城。
1.4 培养基 （1）PDA固体培养基（w/w）：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，KH2PO4 0.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，121℃灭菌20min[10]。（2）液体种子培养基（w/w）：酵母膏0.3%，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，pH自然，121℃灭菌20min[10]。（3）固态发酵基础培养基：在250mL三角瓶中装竹粉30g，含水率60%，121℃灭菌20min[10]。
1.5 固态发酵 参照王超等固态培养方法[10]。
1.6 生化参数的测定 （1）粗酶液制备及酶活测定：参照高恩丽等方法并改进[11]。参照黄丹莲等方法并改进[12]。（2）生物量的测定：用氨基葡糖法，参照彭丹方法测定[13]。
2 结果与分析
2.1 C. subvermispora NL-4生长曲线和产酶曲线 将液体种子以10%接种量接入固体发酵基础培养基中，180r/min、28℃培养16d，漆酶产量和生物量如图1。由图1中菌体的生长曲线显示，在前4d之内，菌体生长较慢，之后在4～8d之内菌体干重增加较快，呈现出对数生长期，8～11d后保持基本稳定[10]。酶活曲线显示，C. subvermispora NL-4在固态发酵条件下，第5d才开始产酶，第12d漆酶活力达到最高，因此初步确定12d为后续发酵条件研究的培养时间。
2.2 培养温度对C. subvermispora NL-4固态发酵产漆酶的影响 将固态发酵基础培养基分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下，180r/min、恒温培养12d后测漆酶产量，结果如图2。图2表明，培养温度对C. subvermispora NL-4固态发酵产漆酶的影响较大，30℃时漆酶酶活达到最高，40℃时仅为最高酶活的39%，因此确定30℃为固态发酵产漆酶的最适培养温度[10]。
2.3 起始含水率对C. subvermispora NL-4固态发酵产漆酶的影响 将固态发酵基础培养基的含水率分别调为44%、48%、52%、56%、60%、64%、68%和72%，180r/min、30℃培养12d后测漆酶产量，结果见图3。图3显示，随着培养基含水量的增加，漆酶活力也有提高，当培养基的含水率64%时，漆酶活力最高。含水率继续增加时，漆酶活力迅速下降。 2.4 起始pH对C. subvermispora NL-4固态发酵产漆酶的影响 将固态发酵基础培养基的pH分别调为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在180r/min、培养基的含水率64%、30℃培养12d，测得的漆酶活力见图4。图4显示，培养基pH会影响菌株固态发酵产酶的活力，当pH为6.0和6.5时，漆酶活力均很高，但pH再增加时，漆酶活力有较大下降。因此选择起始pH为6.0。
2.5 接种量对C. subvermispora NL-4固态发酵产漆酶的影响 在固态发酵基础培养基中，分别接入3%、6%、9%、12%、15%、18%的液体种子，培养基的含水率64%、起始pH 6.0、在180r/min、30℃培养12d，结果见图5。图5显示，接种量不同，漆酶活力变化不明显，当接种量为12%时，漆酶活力最高。接种量增加到15%时，漆酶活力并无明显提高反而下降，因此选择12%为最适宜接种量。
2.6 C. subvermispora NL-4固态发酵产酶曲线 以竹粉为固体发酵基质，采用优化培养基及培养条件进行培养，即接种量12%、培养基起始含水率64%、起始pH6.0、在180r/min、30℃培养16d，研究C. subvermispora NL-4的菌丝体生物量以其漆酶活力的变化，如图6。与优化前相同，最初1～2d，菌体量增长缓慢；而随着培养时间的延长，菌体生物量逐渐增加；在第4～7d呈现对数生长期，第9生物量最大；菌株在第5d产酶量开始有较明显增加，第10d达到最高峰（12.45U/g干基）[10]。
3 结论
（1）对培养条件的优化结果为：培养温度30℃、培养基起始含水率64%、起始pH6.0、接种量12%。
（2）按优化后培养条件，C. subvermispora NL-4在第10d后其产漆酶活力达到最大值12.45 U/g干基，比优化前提高了40%。
参考文献
[1]Ge Hong-hua，Wu Yun，Xiao Ya-zhong.Structure，catalytic mechanism and application of laccases：a review[J].Chin J Biotech，2011，27（2）：156-163.
[2]Abadulla E，Tzanov T，Costa S，et al.Decolorization and detoxification of textile dyes with a laccase from Trametes hirsute[J].Appl Environ Microbiol，2000，66（8）：3357-3362.
[3]梁朝宁，薛燕芬，马延和.微生物降解利用木质纤维素的协同作用[J].生物工程学报，2010，26（10）：1327-1332.
[4]Chao Wang，Xuejun Yu，Hong Xu.Purification and characterization of Laccase from Ceriporiopsis subvermispora[J].Asian Journal of Chemistry，2014（26）.
[5]王超，徐虹.固态发酵产漆酶及其对竹木质素的降解[J].中国食品学报，2013，13（12）：59-64.
[6]Kalogeris E，Iniotaki F，Topakas E，et al.Performance of an intermittent agitation rotating drum type bioreactor for solid-state fermentation of wheat straw[J].Bioresource Technol，2003，86（3）：207-213.
[7]Stepanova E V，Komleva O V，Vasilchenko L G，et a1.Fungal decomposition of oat straw during liquid and solid-state fermentation[J].Applied Biochemistry and Microbiology，2003，39（1）：65-74.
[8]Zhang Yu，Xu Jingliang，Li Dong.Research Progress of Lignin Degradationa Fungi Ceriporiopsis Subvermispora[J].Journal of Wuhan University of Technology，2009，31（10）：104-108.
[9]Chao Wang，Linlin Zhang，Hong Xu.The effects of N+ Ion implantation mutagenesis on the laccase production of Ceriporiopsis subvermispora.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2012，（17）：946-951.（SCI）
[10]王超，余学军，张琳琳，等.虫拟蜡菌固态发酵产漆酶条件优化[J].中国食品学报，2013，13（6）：97-103.
[11]高恩丽.固态发酵产漆酶及其应用基础研究[D].杭州：浙江大学，2007：17-18.
[12]Huang Danlian，Zeng Guangming，Huang Guohe，et al.Optimum conditions of solid-state fermentation for white-rot fungi and It’s degrading straw[J].Acta Scientiae Circumstance，2005，25（2）：232-237.
[13]Peng Dan，Xie Gengxin，Zeng Guangming，et al.Research and Application of Producing Laccase by Phanerochaete chrysosporium in Solid-State Fermentation System[J].Environmental Science，2008，29（12）：3568-3573. （責编：张宏民）
关键词：虫拟蜡菌；固态发酵；漆酶
中图分类号 TQ925 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）08-0018-03
Abstract：Effect of culture conditions for the production of laccase by Ceriporiopsis subvermispora NL-4 were investigated in solid-state fermentation using the milled bamboo as main substrate.The results of single-factor test showed that the optimal culture conditions of the temperature，moisture of medium，inoulum volume and the initial pH were 30℃，64%，12% and 6.0.After the strain of C. subvermispora NL-4 was cultured for 10d growth under the conditions of the above parameters，the laccase activity was up to 12.45U/g dry medium，which was 40% higher than that under the primitive conditions.
Key words：Ceriporiopsis subvermispor；Solid-fermentation；Laccase
漆酶（laccase，p-diphenoloxidase，E.C.1.10.3.2）最初是從漆树中获得的，随着生物技术的发展，微生物源漆酶有了较大的发展。由于漆酶在多个领域具有广泛的用途，对漆酶的需求日益增多[1-2]。但目前微生物产漆酶的产量仍不高[3]，培养期过长导致染菌的可能性增大；漆酶的产量过低严重制约了其分离提取和纯化[4]。采用农林生物质资源作为主要基质，通过固态培养的方式探索漆酶的产生及其产量的提高，不但可以有效节约资源，降低生产成本，减少污染物的排放[5]；同时，与液体发酵相比，固态发酵更接近于自然界的生态环境，有利于菌株产酶[6-7]。虫拟蜡菌（Ceriporiopsis subvermispor）[8]是一类高产漆酶的白腐菌，本研究室对其进行了菌株的诱变，获得了一株漆酶产量明显提高的菌株C. subvermispora NL-4[9]。因此，本研究以Ceriporiopsis subvermispora NL-4为发酵菌株，以竹粉为主要基质，对该菌固态发酵产漆酶的条件进行优化，以提高漆酶产量和产酶效率[10]。
1 材料与方法
1.1 菌株 C. subvermispora NL-4，本研究室诱变选育获得。
1.2 竹粉 竹粉，为毛竹（Phyllostachys pubescens）的加工剩余物，产自浙江临安，烘干后过40目筛，干燥贮存备用。
1.3 试剂 葡萄糖等均为国产分析纯，购自杭州木木生物科技有限公司；ABTS，购于sigma公司；马铃薯等购于临安浙皖农贸城。
1.4 培养基 （1）PDA固体培养基（w/w）：马铃薯20%，葡萄糖2%，琼脂2%，KH2PO4 0.3%，MgSO4·7H2O 0.15%，121℃灭菌20min[10]。（2）液体种子培养基（w/w）：酵母膏0.3%，葡萄糖2%，蛋白胨0.5%，pH自然，121℃灭菌20min[10]。（3）固态发酵基础培养基：在250mL三角瓶中装竹粉30g，含水率60%，121℃灭菌20min[10]。
1.5 固态发酵 参照王超等固态培养方法[10]。
1.6 生化参数的测定 （1）粗酶液制备及酶活测定：参照高恩丽等方法并改进[11]。参照黄丹莲等方法并改进[12]。（2）生物量的测定：用氨基葡糖法，参照彭丹方法测定[13]。
2 结果与分析
2.1 C. subvermispora NL-4生长曲线和产酶曲线 将液体种子以10%接种量接入固体发酵基础培养基中，180r/min、28℃培养16d，漆酶产量和生物量如图1。由图1中菌体的生长曲线显示，在前4d之内，菌体生长较慢，之后在4～8d之内菌体干重增加较快，呈现出对数生长期，8～11d后保持基本稳定[10]。酶活曲线显示，C. subvermispora NL-4在固态发酵条件下，第5d才开始产酶，第12d漆酶活力达到最高，因此初步确定12d为后续发酵条件研究的培养时间。
2.2 培养温度对C. subvermispora NL-4固态发酵产漆酶的影响 将固态发酵基础培养基分别在15℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃条件下，180r/min、恒温培养12d后测漆酶产量，结果如图2。图2表明，培养温度对C. subvermispora NL-4固态发酵产漆酶的影响较大，30℃时漆酶酶活达到最高，40℃时仅为最高酶活的39%，因此确定30℃为固态发酵产漆酶的最适培养温度[10]。
2.3 起始含水率对C. subvermispora NL-4固态发酵产漆酶的影响 将固态发酵基础培养基的含水率分别调为44%、48%、52%、56%、60%、64%、68%和72%，180r/min、30℃培养12d后测漆酶产量，结果见图3。图3显示，随着培养基含水量的增加，漆酶活力也有提高，当培养基的含水率64%时，漆酶活力最高。含水率继续增加时，漆酶活力迅速下降。 2.4 起始pH对C. subvermispora NL-4固态发酵产漆酶的影响 将固态发酵基础培养基的pH分别调为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5，在180r/min、培养基的含水率64%、30℃培养12d，测得的漆酶活力见图4。图4显示，培养基pH会影响菌株固态发酵产酶的活力，当pH为6.0和6.5时，漆酶活力均很高，但pH再增加时，漆酶活力有较大下降。因此选择起始pH为6.0。
2.5 接种量对C. subvermispora NL-4固态发酵产漆酶的影响 在固态发酵基础培养基中，分别接入3%、6%、9%、12%、15%、18%的液体种子，培养基的含水率64%、起始pH 6.0、在180r/min、30℃培养12d，结果见图5。图5显示，接种量不同，漆酶活力变化不明显，当接种量为12%时，漆酶活力最高。接种量增加到15%时，漆酶活力并无明显提高反而下降，因此选择12%为最适宜接种量。
2.6 C. subvermispora NL-4固态发酵产酶曲线 以竹粉为固体发酵基质，采用优化培养基及培养条件进行培养，即接种量12%、培养基起始含水率64%、起始pH6.0、在180r/min、30℃培养16d，研究C. subvermispora NL-4的菌丝体生物量以其漆酶活力的变化，如图6。与优化前相同，最初1～2d，菌体量增长缓慢；而随着培养时间的延长，菌体生物量逐渐增加；在第4～7d呈现对数生长期，第9生物量最大；菌株在第5d产酶量开始有较明显增加，第10d达到最高峰（12.45U/g干基）[10]。
3 结论
（1）对培养条件的优化结果为：培养温度30℃、培养基起始含水率64%、起始pH6.0、接种量12%。
（2）按优化后培养条件，C. subvermispora NL-4在第10d后其产漆酶活力达到最大值12.45 U/g干基，比优化前提高了40%。
参考文献
[1]Ge Hong-hua，Wu Yun，Xiao Ya-zhong.Structure，catalytic mechanism and application of laccases：a review[J].Chin J Biotech，2011，27（2）：156-163.
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[7]Stepanova E V，Komleva O V，Vasilchenko L G，et a1.Fungal decomposition of oat straw during liquid and solid-state fermentation[J].Applied Biochemistry and Microbiology，2003，39（1）：65-74.
[8]Zhang Yu，Xu Jingliang，Li Dong.Research Progress of Lignin Degradationa Fungi Ceriporiopsis Subvermispora[J].Journal of Wuhan University of Technology，2009，31（10）：104-108.
[9]Chao Wang，Linlin Zhang，Hong Xu.The effects of N+ Ion implantation mutagenesis on the laccase production of Ceriporiopsis subvermispora.Biotechnology and Bioprocess Engineering，2012，（17）：946-951.（SCI）
[10]王超，余学军，张琳琳，等.虫拟蜡菌固态发酵产漆酶条件优化[J].中国食品学报，2013，13（6）：97-103.
[11]高恩丽.固态发酵产漆酶及其应用基础研究[D].杭州：浙江大学，2007：17-18.
[12]Huang Danlian，Zeng Guangming，Huang Guohe，et al.Optimum conditions of solid-state fermentation for white-rot fungi and It’s degrading straw[J].Acta Scientiae Circumstance，2005，25（2）：232-237.
[13]Peng Dan，Xie Gengxin，Zeng Guangming，et al.Research and Application of Producing Laccase by Phanerochaete chrysosporium in Solid-State Fermentation System[J].Environmental Science，2008，29（12）：3568-3573. （責编：张宏民）