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摘要：目的 观察愈肾合剂对糖尿病模型大鼠肾脏组织血红素氧合酶（HO）-1、HO-2的影响，探讨其治疗糖尿病肾病作用机制。方法 SD大鼠随机分为正常组、模型组、对照组、治疗组。采用皮下注射链脲佐菌素法复制模型，对照组和治疗组给予相应药物灌胃，正常组和模型组灌胃等量蒸馏水。给药8周后，收集尿液测定24 h尿蛋白（Upro）、尿肌酐（Ucr），断头取血测定一氧化碳（CO）、尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），采用免疫组织化学法检测肾脏组织HO-1、HO-2的表达。结果 与正常组比较，模型组大鼠BUN、24 h Upro、Scr升高，肌酐清除值（Ccr）、血浆CO降低，肾脏组织的HO-1、HO-2表达明显减弱（P<0.01）；与模型组比较，治疗组和对照组BUN、24 h Upro、Scr明显下降，Ccr、血浆CO活性升高，肾脏组织的HO-1、HO-2表达明显增强（P<0.05，P<0.01）；与对照组比较，治疗组24 h Upro降低，血浆CO活性升高，肾脏组织HO-1、HO-2表达明显增强（P<0.05，P<0.01）。结论 愈肾合剂对糖尿病肾病大鼠有一定的治疗作用，可能是通过HO/CO系统实现的。
关键词：愈肾合剂；糖尿病肾病；内源性一氧化碳；血红素氧合酶-1；血红素氧合酶-2；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.018
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）09-0061-03
基金项目：河北省教育厅科研计划（2007439）
通讯作者：成秀梅，E-mail：xiumeicheng@126.com
糖尿病肾病（DN）是糖尿病常见的微血管并发症之一，目前对本病尚无理想的治疗方法和药物。我们应用经验方愈肾合剂治疗DN取得了较好的临床疗效[1]，并通过动物实验研究表明，愈肾合剂能够改善动物肾功能，减少蛋白尿，调节肾脏细胞转化生长因子-β1（TGF-β1）和血小板衍生生长因子-B（PDGF-B）的表达，抑制肾脏细胞凋亡[2-3]。近年研究表明，肾脏组织血红素氧合酶（HO）-1、HO-2参与了DN的发生和发展[4]，本实验通过观察愈肾合剂对糖尿病大鼠肾组织HO-1、HO-2表达的影响，进一步探讨其治疗DN的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康SD大鼠50只，雌雄各半，体质量160～190 g，鼠龄4～6周，河北医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（冀）2003-1-003。
1.2 药物
愈肾合剂由大黄、黄芪、桑寄生、川芎、水蛭、党参、茯苓等组成，购自石家庄乐仁堂药房；卡托普利片，常州制药厂有限公司生产，批号990376-2，用蒸馏水配制成浓度为50%的悬浊液；格列喹酮片，北京万辉药业集团生产，批号990630。
1.3 主要试剂及仪器
链脲佐菌素（STZ）试剂盒（美国Sigma公司）， HO-1、HO-2试剂盒（上海沪尚生物科技有限公司）， HO-1鼠多抗、HO-2兔多抗（Santa Cruz公司）。半自动生化分析仪（Hymalyzer2000德国豪迈），组织型切片机RM2125（上海莱卡仪器有限公司），生物组织包埋机（JB-L5 武汉俊杰电子有限公司）。
2 实验方法
2.1 造模与分组
大鼠适应性喂养1周后，按Anderson等[5]方法建立模型。随机抽取10只大鼠暴露肾脏后缝合，作为正常组，其余40只大鼠行右肾切除术，2周后切口完全愈合。切除肾脏的大鼠按45 mg/kg皮下注射STZ，使用时溶于0.1 mmol/L、pH 4.5的枸橼酸缓冲液中。实验期间动物自由进食、饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物。48 h后尾尖取血，测定血糖；取尿测尿糖。血糖≥16.7 mmol/L、尿糖阳性、尿蛋白阳性、尿量>正常组150%者确定为模型。共35只大鼠成模。随机取30只分为模型组、治疗组、对照组，每组10只。
2.2 给药
愈肾合剂在石家庄市中医院中药制剂室常规水煎，醇提，浓缩成含3.32 g原药材/mL药液，置于4 ℃冰箱备用，用时取出，用蒸馏水稀释至所用浓度。治疗组和对照组均给予格列喹酮片5 mg/kg。同时，治疗组每日灌胃愈肾合剂，用药剂量为3.32 g/kg（相当为成人剂量的20倍），对照组每日格列喹酮片10 mg/kg（相当为成人剂量的20倍）灌胃。给药容积10 mL/kg，正常组和模型组灌胃等量蒸馏水，1次/d，共8周。
2.3 肾功能及尿蛋白检测
给药8周后，用代谢笼收集24 h尿，测定24 h尿蛋白（Upro）、尿肌酐（Ucr）含量；禁食8 h，称重，断头取血，分离血清，测尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），计算肌酐清除值（Ccr），Ccr=Scr×每分钟尿量÷Ucr。
2.4 血浆一氧化碳检测
给药8周后，禁食8 h后断头取血，测定血浆一氧化碳（CO）水平[6]。取血0.1 mL，取10 μL溶血后加NaS2O4 25 mg，将血中多组分的Hb转化为单一Hb和一氧化碳血红蛋白（COHb）2个组分，采用420 nm和432 nm 2个波长比色，记录吸光度值，依比尔定律建立方程式，计算COHb的百分含量。
2.5 肾组织血红素氧合酶-1、血红素氧合酶-2表达检测
给药8周后，禁食8 h后断头处死大鼠，剖取左肾组织（1 cm×1 cm×1 cm），于4%多聚甲醛中固定，经自动脱水机逐级酒精脱水，过夜，浸蜡，石蜡包埋；组织切片机连续切片，片厚4 μm。采用免疫组织化学法检测肾组织HO-1、HO-2表达。阳性结果判定：经DAB显色后，细胞胞浆中出现棕黄色反应产物者为HO-1、HO-2免疫阳性，反应产物颜色浅、颗粒稀疏者为阳性信号弱，反应产物颜色深、颗粒密集者为阳性信号强。显微照相系统对切片进行观察，采用HPIAS-1000彩色病理图像分析系统，在100×视野下每张切片取5个视野，测定平均灰度值作半定量分析。 3 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据用 —x±s表示，多组间均数比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 愈肾合剂对大鼠尿蛋白及肾功能的影响
与正常组比较，模型组BUN、Scr明显升高（P<0.01）；与模型组比较，治疗组和对照组BUN、Scr明显降低（P<0.01）。与正常组比较，模型组Ccr明显降低（P<0.01）；与模型组比较，治疗组、对照组Ccr明显升高（P<0.05）。与正常组比较，模型组大鼠24 h Upro水平明显升高（P<0.01）；与模型组比较，治疗组和对照组24 h Upro明显降低（P<0.01），2组比较差异有统计学意义（P<0.05）
4.2 愈肾合剂对大鼠血浆一氧化碳的影响
模型组大鼠血浆CO明显低于正常组（P<0.01）；与模型组比较，治疗组、对照组大鼠血浆CO明显升高（P<0.05，P<0.01）；治疗组与对照组比较，血浆CO明显升高（P<0.05）。4.3 愈肾合剂对大鼠肾组织血红素氧合酶-1、血红素氧合酶-2表达的影响
5 讨论
DN属中医“消渴”、“水肿”、“肾消”等范畴，多表现为气阴两虚夹痰湿瘀血，以气阴两虚为本，痰浊、瘀血为标，瘀阻肾络导致本病的发生[7]。方中黄芪益气补虚，党参益气健脾，大黄泄热解毒降浊，桑寄生补肾壮腰、强健筋骨，水蛭行血散瘀。全方具有益气扶正、活血通络、解毒降浊的作用。本实验结果表明，愈肾合剂能够改善模型大鼠的肾功能，降低尿蛋白。
HO是生物体内催化血红素分解成胆绿素、CO和铁离子过程中一种关键的限速酶，有着重要的生物学作用。HO有3种形式的同工酶，即诱导型（HO-1）、结构型（HO-2）及HO-3。HO-3的功能尚不十分清楚，HO-2在生理状态下表达，催化CO生成，发挥生理调节作用；而HO-1则在病理情况下表达增多，介导血管系统组织细胞的抗应激损伤机制，保持血管功能的完整性。HO/CO有细胞保护作用、舒张血管作用、促进血管生成等很重要的生物学效应[8]。
本实验结果表明，在大鼠肾组织HO-1、HO-2均有表达，模型大鼠肾组织HO-1、HO-2表达均明显减弱，血浆CO活性降低，提示HO/CO的调节失常参与了DN的发生和发展，分析可能与HO/CO活性降低，导致血管扩张、细胞保护、抗氧化等作用减弱，细胞凋亡加速，氧化损伤加重，肾小球硬化，肾小球的滤过率降低有关。经过治疗，大鼠肾组织HO-1、HO-2表达较模型组均明显增强，CO活性明显升高；尤以治疗组更为明显，说明愈肾合剂能够使肾组织HO-1、HO-2表达上调，提高CO活性。并且随着肾组织HO-1、HO-2表达上调，CO活性升高，大鼠尿蛋白减少，BUN、Scr降低，肾功能得到明显改善。因此，推测愈肾合剂治疗DN保护肾功能的作用，可能是通过影响HO/CO系统而实现。
参考文献：
[1] 成秀梅，陈骅，马金萍.中西医结合延缓糖尿病肾病肾衰发展速度的临床研究[J].中级医刊，1999，34（3）：35.
[2] 成秀梅，常风云，王晓松，等.愈肾合剂对糖尿病肾病肾脏细胞TGF-β1和PDGF-B表达的影响[J].中国医科大学学报，2008，37（6）：742-744.
[3] 常庚，成秀梅，王晓松，等.愈肾合剂对糖尿病肾病大鼠肾脏细胞凋亡及ERK信号转导系统的影响[J].中国老年学杂志，2011，31（4）：607-609.
[4] 王晓松，成秀梅，曹焕敏，等.HO-1、HO-2在糖尿病大鼠肾脏的表达及其意义[J].吉林大学学报：医学版，2011，37（3）：479-482.
[5] Anderson S， Rennke HG， Brenner BM. Nigedipine versus fosinopril in uninephrectomized diabetic rats[J]. Kidney Int，1992，41（4）：891-897.
[6] 乐宏元，宋小兴，刘和平.一氧化碳血红蛋白双波长定量测量[J].临床检验杂志，1996，14（2）：87-88.
[7] 林兰，倪青，庞健丽，等.基于数据挖掘技术的2型糖尿病辨证规范前瞻性研究[J].中国中医药信息杂志，2011，18（7）：9-12.
[8] 刘立君.血红素加氧酶与急性脑血管疾病[J].医学理论与实践，2010， 23（6）：646-648.
（收稿日期：2013-12-18；编辑：华强）
关键词：愈肾合剂；糖尿病肾病；内源性一氧化碳；血红素氧合酶-1；血红素氧合酶-2；大鼠
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2014.09.018
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2014）09-0061-03
基金项目：河北省教育厅科研计划（2007439）
通讯作者：成秀梅，E-mail：xiumeicheng@126.com
糖尿病肾病（DN）是糖尿病常见的微血管并发症之一，目前对本病尚无理想的治疗方法和药物。我们应用经验方愈肾合剂治疗DN取得了较好的临床疗效[1]，并通过动物实验研究表明，愈肾合剂能够改善动物肾功能，减少蛋白尿，调节肾脏细胞转化生长因子-β1（TGF-β1）和血小板衍生生长因子-B（PDGF-B）的表达，抑制肾脏细胞凋亡[2-3]。近年研究表明，肾脏组织血红素氧合酶（HO）-1、HO-2参与了DN的发生和发展[4]，本实验通过观察愈肾合剂对糖尿病大鼠肾组织HO-1、HO-2表达的影响，进一步探讨其治疗DN的作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
健康SD大鼠50只，雌雄各半，体质量160～190 g，鼠龄4～6周，河北医科大学动物实验中心提供，许可证号：SCXK（冀）2003-1-003。
1.2 药物
愈肾合剂由大黄、黄芪、桑寄生、川芎、水蛭、党参、茯苓等组成，购自石家庄乐仁堂药房；卡托普利片，常州制药厂有限公司生产，批号990376-2，用蒸馏水配制成浓度为50%的悬浊液；格列喹酮片，北京万辉药业集团生产，批号990630。
1.3 主要试剂及仪器
链脲佐菌素（STZ）试剂盒（美国Sigma公司）， HO-1、HO-2试剂盒（上海沪尚生物科技有限公司）， HO-1鼠多抗、HO-2兔多抗（Santa Cruz公司）。半自动生化分析仪（Hymalyzer2000德国豪迈），组织型切片机RM2125（上海莱卡仪器有限公司），生物组织包埋机（JB-L5 武汉俊杰电子有限公司）。
2 实验方法
2.1 造模与分组
大鼠适应性喂养1周后，按Anderson等[5]方法建立模型。随机抽取10只大鼠暴露肾脏后缝合，作为正常组，其余40只大鼠行右肾切除术，2周后切口完全愈合。切除肾脏的大鼠按45 mg/kg皮下注射STZ，使用时溶于0.1 mmol/L、pH 4.5的枸橼酸缓冲液中。实验期间动物自由进食、饮水，不使用胰岛素及其他降糖药物。48 h后尾尖取血，测定血糖；取尿测尿糖。血糖≥16.7 mmol/L、尿糖阳性、尿蛋白阳性、尿量>正常组150%者确定为模型。共35只大鼠成模。随机取30只分为模型组、治疗组、对照组，每组10只。
2.2 给药
愈肾合剂在石家庄市中医院中药制剂室常规水煎，醇提，浓缩成含3.32 g原药材/mL药液，置于4 ℃冰箱备用，用时取出，用蒸馏水稀释至所用浓度。治疗组和对照组均给予格列喹酮片5 mg/kg。同时，治疗组每日灌胃愈肾合剂，用药剂量为3.32 g/kg（相当为成人剂量的20倍），对照组每日格列喹酮片10 mg/kg（相当为成人剂量的20倍）灌胃。给药容积10 mL/kg，正常组和模型组灌胃等量蒸馏水，1次/d，共8周。
2.3 肾功能及尿蛋白检测
给药8周后，用代谢笼收集24 h尿，测定24 h尿蛋白（Upro）、尿肌酐（Ucr）含量；禁食8 h，称重，断头取血，分离血清，测尿素氮（BUN）、血肌酐（Scr），计算肌酐清除值（Ccr），Ccr=Scr×每分钟尿量÷Ucr。
2.4 血浆一氧化碳检测
给药8周后，禁食8 h后断头取血，测定血浆一氧化碳（CO）水平[6]。取血0.1 mL，取10 μL溶血后加NaS2O4 25 mg，将血中多组分的Hb转化为单一Hb和一氧化碳血红蛋白（COHb）2个组分，采用420 nm和432 nm 2个波长比色，记录吸光度值，依比尔定律建立方程式，计算COHb的百分含量。
2.5 肾组织血红素氧合酶-1、血红素氧合酶-2表达检测
给药8周后，禁食8 h后断头处死大鼠，剖取左肾组织（1 cm×1 cm×1 cm），于4%多聚甲醛中固定，经自动脱水机逐级酒精脱水，过夜，浸蜡，石蜡包埋；组织切片机连续切片，片厚4 μm。采用免疫组织化学法检测肾组织HO-1、HO-2表达。阳性结果判定：经DAB显色后，细胞胞浆中出现棕黄色反应产物者为HO-1、HO-2免疫阳性，反应产物颜色浅、颗粒稀疏者为阳性信号弱，反应产物颜色深、颗粒密集者为阳性信号强。显微照相系统对切片进行观察，采用HPIAS-1000彩色病理图像分析系统，在100×视野下每张切片取5个视野，测定平均灰度值作半定量分析。 3 统计学方法
采用SPSS11.5统计软件进行分析。实验数据用 —x±s表示，多组间均数比较采用方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 愈肾合剂对大鼠尿蛋白及肾功能的影响
与正常组比较，模型组BUN、Scr明显升高（P<0.01）；与模型组比较，治疗组和对照组BUN、Scr明显降低（P<0.01）。与正常组比较，模型组Ccr明显降低（P<0.01）；与模型组比较，治疗组、对照组Ccr明显升高（P<0.05）。与正常组比较，模型组大鼠24 h Upro水平明显升高（P<0.01）；与模型组比较，治疗组和对照组24 h Upro明显降低（P<0.01），2组比较差异有统计学意义（P<0.05）
4.2 愈肾合剂对大鼠血浆一氧化碳的影响
模型组大鼠血浆CO明显低于正常组（P<0.01）；与模型组比较，治疗组、对照组大鼠血浆CO明显升高（P<0.05，P<0.01）；治疗组与对照组比较，血浆CO明显升高（P<0.05）。4.3 愈肾合剂对大鼠肾组织血红素氧合酶-1、血红素氧合酶-2表达的影响
5 讨论
DN属中医“消渴”、“水肿”、“肾消”等范畴，多表现为气阴两虚夹痰湿瘀血，以气阴两虚为本，痰浊、瘀血为标，瘀阻肾络导致本病的发生[7]。方中黄芪益气补虚，党参益气健脾，大黄泄热解毒降浊，桑寄生补肾壮腰、强健筋骨，水蛭行血散瘀。全方具有益气扶正、活血通络、解毒降浊的作用。本实验结果表明，愈肾合剂能够改善模型大鼠的肾功能，降低尿蛋白。
HO是生物体内催化血红素分解成胆绿素、CO和铁离子过程中一种关键的限速酶，有着重要的生物学作用。HO有3种形式的同工酶，即诱导型（HO-1）、结构型（HO-2）及HO-3。HO-3的功能尚不十分清楚，HO-2在生理状态下表达，催化CO生成，发挥生理调节作用；而HO-1则在病理情况下表达增多，介导血管系统组织细胞的抗应激损伤机制，保持血管功能的完整性。HO/CO有细胞保护作用、舒张血管作用、促进血管生成等很重要的生物学效应[8]。
本实验结果表明，在大鼠肾组织HO-1、HO-2均有表达，模型大鼠肾组织HO-1、HO-2表达均明显减弱，血浆CO活性降低，提示HO/CO的调节失常参与了DN的发生和发展，分析可能与HO/CO活性降低，导致血管扩张、细胞保护、抗氧化等作用减弱，细胞凋亡加速，氧化损伤加重，肾小球硬化，肾小球的滤过率降低有关。经过治疗，大鼠肾组织HO-1、HO-2表达较模型组均明显增强，CO活性明显升高；尤以治疗组更为明显，说明愈肾合剂能够使肾组织HO-1、HO-2表达上调，提高CO活性。并且随着肾组织HO-1、HO-2表达上调，CO活性升高，大鼠尿蛋白减少，BUN、Scr降低，肾功能得到明显改善。因此，推测愈肾合剂治疗DN保护肾功能的作用，可能是通过影响HO/CO系统而实现。
参考文献：
[1] 成秀梅，陈骅，马金萍.中西医结合延缓糖尿病肾病肾衰发展速度的临床研究[J].中级医刊，1999，34（3）：35.
[2] 成秀梅，常风云，王晓松，等.愈肾合剂对糖尿病肾病肾脏细胞TGF-β1和PDGF-B表达的影响[J].中国医科大学学报，2008，37（6）：742-744.
[3] 常庚，成秀梅，王晓松，等.愈肾合剂对糖尿病肾病大鼠肾脏细胞凋亡及ERK信号转导系统的影响[J].中国老年学杂志，2011，31（4）：607-609.
[4] 王晓松，成秀梅，曹焕敏，等.HO-1、HO-2在糖尿病大鼠肾脏的表达及其意义[J].吉林大学学报：医学版，2011，37（3）：479-482.
[5] Anderson S， Rennke HG， Brenner BM. Nigedipine versus fosinopril in uninephrectomized diabetic rats[J]. Kidney Int，1992，41（4）：891-897.
[6] 乐宏元，宋小兴，刘和平.一氧化碳血红蛋白双波长定量测量[J].临床检验杂志，1996，14（2）：87-88.
[7] 林兰，倪青，庞健丽，等.基于数据挖掘技术的2型糖尿病辨证规范前瞻性研究[J].中国中医药信息杂志，2011，18（7）：9-12.
[8] 刘立君.血红素加氧酶与急性脑血管疾病[J].医学理论与实践，2010， 23（6）：646-648.
（收稿日期：2013-12-18；编辑：华强）