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摘要
[目的]对从紫海胆肠道分离得到的曲霉菌（Aspergillus sp.）菌株HDf2进行次生代谢产物研究。[方法]采用液体发酵，运用柱层析方法从培养液中分离、纯化单体化合物。[结果]从乙酸乙酯提取物较高极性段分离得到1个单体化合物，通过波谱解析和与文献对照将其鉴定为nonadride类化合物glauconic acid。[结论]该研究首次报道了海洋来源的真菌产天然界稀有的nonadride类天然化合物glauconic acid。
关键词紫海胆；曲霉菌；海洋真菌；nonadride
中图分类号S917.1；O629.9文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-001-02
海洋微生物是寻找结构新颖分子的一个新源泉。通过对海洋微生物的次生代谢天然产物研究，发现许多具有生物活性的结构新颖化合物[1]。海洋真菌常与海洋生物形成共生。独特的生存环境使其能够产生众多结构多样的活性天然产物，诸如抗菌、抗肿瘤、抗污损的萜类、生物碱类天然化合物[2-5]。近年来，笔者对来自南中国海紫海胆的肠道真菌曲霉菌（Aspergillus sp.）菌株HDf2 的次级代谢产物进行系统的研究，从中分离、鉴定出一系列具有抗菌、抗污损活性的新型刺孢青霉素类化合物[6-8]。为充分挖掘该菌产结构新颖性分子的潜力，依据OSMAC（one strainmany compounds）策略[9]，笔者通过改变发酵培养基对该菌进行发酵，从其发酵液的乙酸乙酯提取物中分离得到化合物1，通过波谱解析和与文献对照鉴定为天然界稀有的nonadride类化合物glauconic acid。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
仪器与试剂。高分辨质谱数据由Agilent 6210 TOF LCMS质谱仪测定；化合物1D和2D谱图由Bruker Avance III500核磁共振波谱仪测定，以TMS为内标；薄层层析硅胶（GF254）和层析柱硅胶（200～300目）均为青岛海洋化工厂出品；Sephadex LH20和ODS反相硅胶分别购自瑞士GE Healthcare BioSciences 和日本YMC公司；HPLC试验中使用色谱试剂购自美国Tedia Company Inc.，其余试剂均为分析纯。
1.1.2
培养基。真菌培养与发酵用培养基为马铃薯葡萄糖培养基（PDA）平板，组成为：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂条20 g、水1 000 ml。将马铃薯切小块，沸水煮30 min后过滤、定容、分装灭菌。发酵培养基为液体PDA。
1.1.3
菌株。曲霉菌菌株HDf2是由笔者从南中国海海岸采集的紫海胆中分离得到的[8]。
1.2方法
1.2.1
菌株的发酵。曲霉菌菌株HDf2经PDA平板活化，28 ℃暗培养7 d。取菌块直接接种于液体PDA培养基中，每瓶液体培养基450 ml，共接种20瓶Erlenmeyer烧瓶（1 000 ml），于三层摇床上培养2周（120 r/min，28 ℃）。
1.2.2
化合物的分离与纯化。过滤发酵物后得约9 L发酵液，发酵液经等体积的乙酸乙酯萃取3遍，经减压浓缩得粗提物2.8 g。该粗膏经减压硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇梯度洗脱得到6个流份（V/V， 100∶0、100∶1、100∶2、100∶4， 100∶8， 0∶100）。其中，流份4（氯仿-甲醇，100∶4）经C18 ODS反相硅胶柱层析，以甲醇-水梯度洗脱得到6个流份（V/V， 50∶50、60∶40、70∶30、75∶25、85∶15、100∶0）；流份1（甲醇-水，50∶50）经Sephadex LH20凝胶柱层析（甲醇为流动相）和HPLC（甲醇-水，75∶25，加浓度0.1% TFA），得到化合物1 （glauconic acid，2.4 mg， tR=10.1 min）。
2 结果与分析
化合物1无色结晶（甲醇），正源高分辨ESI质谱显示其准分子离子峰为m/z 371.109 8 [M+Na]+，推出其分子式为C18H20O7，不饱和度为9。1HNMR、13CNMR结合DEPT谱可以看出，该化合物含有8个季碳、3个甲基、3个亚甲基和4个次甲基（其中1个次甲基连氧）。δC 177.3、169.9、166.0、165.9的季碳显示分子中有4个酯羰基存在，推测分子中可能存在2个酸酐。δC 151.0的次甲基和δC 150.8、133.4、131.3的季碳提示分子中有2个双键存在。分子中剩余的不饱和度表明还存在3个环。进一步分析该化合物分子式，发现除去4个酯羰基氧和1个连次甲基氧，还剩2个氧，可能每个氧与酯羰基各形成1个五元酸酐环，因此分子中还存在一个环。通过HSQC谱，可判断该化合物中碳上所连接的质子情况。分析1HNMR谱，δ 0.87和1.09为2个三重峰，13CNMR和DEPT135谱中存在2个甲基和2个亚甲基，推断分子中存在2条乙基链。1H1H COSY谱相关信号（图1）可清楚证实上述推断，并揭示分子部分结构片段：H1’与H2’，H2’与H2，H2同时与H3和H1，H1同时与H9和H4’，以及H4’与H3’相关，表明该分子存在此结构片段。进一步分析HMBC谱相关信号，可揭示整个分子的结构：H2与C4，H3与C4和C5，H6与C4、C5和C8，H5’与C6、C7和C8以及H9与C7和C8存在相关，表明该分子中存在1个九元环结构；H3与C10、H6与C11、H9与C13和H5’与C12的HMBC相关证实分子中2个五元酸酐环的位置。通过将上述结构片段连接整理，即可得到化合物1的平面结构（图1）。该化合物的相对构型通过ROESY试验得到确定。H2’与H3存在noe相关，表明其处于同一平面；H1同时与H2和H5’ 存在noe相关，表明其同处于另一平面，从而确定化合物1的相对构型。该化合物的1H和13CNMR数据归属如下：1HNMR （CD3OD， 500 MHz），δ 0.87 （3H， t， J = 7.5 Hz， H3’）， 1.09 （3H， t， J = 7.5 Hz， H1’）， 139 （3H， s， H5’）， 1.57 （1H， m， H2’b） ， 1.59 （1H， m， H4’b）， 1.66 （1H， m， H4’a）， 1.70 （1H， m， H2’a）， 2.38 （1H， m， H2）， 2.47 （1H， m， H1）， 2.85 （1H， d， J = 14.0 Hz， H6b）， 3.28 （1H， d， J = 14.0 Hz， H6a）， 4.21 （1H， d， J = 10.5 Hz， H3）， 6.98 （1H， d， J = 12.0 Hz， H9）； 13CNMR （CD3OD， 125 MHz），δ 13.1 （q， C3’）， 15.2 （q， C1’）， 20.4 （q， C5’）， 21.0 （t， C2’）， 27.7 （t， C4’）， 35.9 （t， C6）， 43.8 （d， C1）， 50.1 （s， C7）， 52.6 （d， C2）， 74.3 （d， C3）， 131.3 （s， C5）， 133.4 （s， C8）， 150.8 （s， C4）， 151.0 （d， C9）， 165.9 （s， C13）， 166.0 （s， C11）， 169.9 （s， C10）， 177.3 （s， C12）。上述數据与文献值[10]基本一致，确定化合物1为glauconic acid。该化合物属于nonadride类化合物，在天然界很少发现。它结构新颖，多具有独特的药理活性[11-13]。 參考文献
[1]
KIURU P，D′AURIA M V，MULLER C D，et al.Exploring marine resources for bioactive compounds[J].Planta Med，2014，80（14）：1234-1246.
[2] HAGA A，TAMOTO H，ISHINO M，et al.Pyridone alkaloids from a marinederived fungus，Stagonosporopsis cucurbitacearum，and their activities against azoleresistant Candida albicans[J].J Nat Prod，2013，76（4）：750-754.
[3] KOCH L，LODIN A，HEROLD I，et al.Sensitivity of Neurospora crassa to a marinederived Aspergillus tubingensis anhydride exhibiting antifungal activity that is mediated by the MAS1 protein[J].Mar Drugs，2014，12（9）：4713-4731.
[4] LIAO L J，LEE J H，YOU M J，et al.Penicillipyrones A and B，meroterpenoids from a marinederived Penicillium sp. fungus[J].J Nat Prod，2014，77（2）：406-410.
[5] WU Z H，LIU D，PROKSCH P，et al.Punctaporonins HM：Caryophyllenetype sesquiterpenoids from the spongeassociated fungus Hansfordia sinuosae[J].Mar Drugs，2014，12（7）：3904-3916.
[6] WANG R，FU Z D，HE X N，et al.New secondary metabolites produced by the marinederived fungus Aspergillus sp.HDf2[J].Chin J Tropical Crops，2014，35（8）：1658-1662.
[7] WANG R，HE H，ZHAN X F，et al.Antifouling secondary metabolites from the sea urchinassociated fungus Aspergillus sp.HDf2[J].J Anhui Agric Sci，2014，42（25）：8492-8493.
[8] WANG R，LIU T M，SHEN M H，et al.Spiculisporic acids BD，three new γbutenolide derivatives from a sea urchinderived fungus Aspergillus sp.HDf2[J].Molecules，2012，17：13175-13182.
[9] HEWAGE R T，AREE T，MAHIDOL C，et al.One strainmany compounds （OSMAC） method for production of polyketides，azaphilones，and an isochromanone using the endophytic fungus Dothideomycete sp.[J].Phytochemistry，2014，108：87-94.
[10] NIEMINEN S，TAMM C.1Hund 13CNMR.spektroskopie der nonadride[J].Helv Chim Acta，1981，64（8）：2791-2801.
[11] SPENCER P，AGNELLI F，WILLIAMS H J，et al.Biosynthetic studies on the fungal secondary metabolites CP225 917 and CP263 114[J].J Am Chem Soc，2000，122：420-421.
[12] WHITE J D，KIM J，DRAPELA N E.Enantiospecific synthesis of （+）byssochlamic acid，a nonadride from the ascomycete Byssochlamys fulva[J].J Am Chem Soc，2000，122：8665-8671.
[13] CHEN X L，ZHENG Y G，SHEN Y C.Natural products with maleic anhydride structure：nonadrides，tautomycin，chaetomellic anhydride，and other compounds[J].Chem Rev，2007，107（5）：1777-1830.
[目的]对从紫海胆肠道分离得到的曲霉菌（Aspergillus sp.）菌株HDf2进行次生代谢产物研究。[方法]采用液体发酵，运用柱层析方法从培养液中分离、纯化单体化合物。[结果]从乙酸乙酯提取物较高极性段分离得到1个单体化合物，通过波谱解析和与文献对照将其鉴定为nonadride类化合物glauconic acid。[结论]该研究首次报道了海洋来源的真菌产天然界稀有的nonadride类天然化合物glauconic acid。
关键词紫海胆；曲霉菌；海洋真菌；nonadride
中图分类号S917.1；O629.9文献标识码A文章编号0517-6611（2015）21-001-02
海洋微生物是寻找结构新颖分子的一个新源泉。通过对海洋微生物的次生代谢天然产物研究，发现许多具有生物活性的结构新颖化合物[1]。海洋真菌常与海洋生物形成共生。独特的生存环境使其能够产生众多结构多样的活性天然产物，诸如抗菌、抗肿瘤、抗污损的萜类、生物碱类天然化合物[2-5]。近年来，笔者对来自南中国海紫海胆的肠道真菌曲霉菌（Aspergillus sp.）菌株HDf2 的次级代谢产物进行系统的研究，从中分离、鉴定出一系列具有抗菌、抗污损活性的新型刺孢青霉素类化合物[6-8]。为充分挖掘该菌产结构新颖性分子的潜力，依据OSMAC（one strainmany compounds）策略[9]，笔者通过改变发酵培养基对该菌进行发酵，从其发酵液的乙酸乙酯提取物中分离得到化合物1，通过波谱解析和与文献对照鉴定为天然界稀有的nonadride类化合物glauconic acid。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1
仪器与试剂。高分辨质谱数据由Agilent 6210 TOF LCMS质谱仪测定；化合物1D和2D谱图由Bruker Avance III500核磁共振波谱仪测定，以TMS为内标；薄层层析硅胶（GF254）和层析柱硅胶（200～300目）均为青岛海洋化工厂出品；Sephadex LH20和ODS反相硅胶分别购自瑞士GE Healthcare BioSciences 和日本YMC公司；HPLC试验中使用色谱试剂购自美国Tedia Company Inc.，其余试剂均为分析纯。
1.1.2
培养基。真菌培养与发酵用培养基为马铃薯葡萄糖培养基（PDA）平板，组成为：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂条20 g、水1 000 ml。将马铃薯切小块，沸水煮30 min后过滤、定容、分装灭菌。发酵培养基为液体PDA。
1.1.3
菌株。曲霉菌菌株HDf2是由笔者从南中国海海岸采集的紫海胆中分离得到的[8]。
1.2方法
1.2.1
菌株的发酵。曲霉菌菌株HDf2经PDA平板活化，28 ℃暗培养7 d。取菌块直接接种于液体PDA培养基中，每瓶液体培养基450 ml，共接种20瓶Erlenmeyer烧瓶（1 000 ml），于三层摇床上培养2周（120 r/min，28 ℃）。
1.2.2
化合物的分离与纯化。过滤发酵物后得约9 L发酵液，发酵液经等体积的乙酸乙酯萃取3遍，经减压浓缩得粗提物2.8 g。该粗膏经减压硅胶柱色谱，以氯仿-甲醇梯度洗脱得到6个流份（V/V， 100∶0、100∶1、100∶2、100∶4， 100∶8， 0∶100）。其中，流份4（氯仿-甲醇，100∶4）经C18 ODS反相硅胶柱层析，以甲醇-水梯度洗脱得到6个流份（V/V， 50∶50、60∶40、70∶30、75∶25、85∶15、100∶0）；流份1（甲醇-水，50∶50）经Sephadex LH20凝胶柱层析（甲醇为流动相）和HPLC（甲醇-水，75∶25，加浓度0.1% TFA），得到化合物1 （glauconic acid，2.4 mg， tR=10.1 min）。
2 结果与分析
化合物1无色结晶（甲醇），正源高分辨ESI质谱显示其准分子离子峰为m/z 371.109 8 [M+Na]+，推出其分子式为C18H20O7，不饱和度为9。1HNMR、13CNMR结合DEPT谱可以看出，该化合物含有8个季碳、3个甲基、3个亚甲基和4个次甲基（其中1个次甲基连氧）。δC 177.3、169.9、166.0、165.9的季碳显示分子中有4个酯羰基存在，推测分子中可能存在2个酸酐。δC 151.0的次甲基和δC 150.8、133.4、131.3的季碳提示分子中有2个双键存在。分子中剩余的不饱和度表明还存在3个环。进一步分析该化合物分子式，发现除去4个酯羰基氧和1个连次甲基氧，还剩2个氧，可能每个氧与酯羰基各形成1个五元酸酐环，因此分子中还存在一个环。通过HSQC谱，可判断该化合物中碳上所连接的质子情况。分析1HNMR谱，δ 0.87和1.09为2个三重峰，13CNMR和DEPT135谱中存在2个甲基和2个亚甲基，推断分子中存在2条乙基链。1H1H COSY谱相关信号（图1）可清楚证实上述推断，并揭示分子部分结构片段：H1’与H2’，H2’与H2，H2同时与H3和H1，H1同时与H9和H4’，以及H4’与H3’相关，表明该分子存在此结构片段。进一步分析HMBC谱相关信号，可揭示整个分子的结构：H2与C4，H3与C4和C5，H6与C4、C5和C8，H5’与C6、C7和C8以及H9与C7和C8存在相关，表明该分子中存在1个九元环结构；H3与C10、H6与C11、H9与C13和H5’与C12的HMBC相关证实分子中2个五元酸酐环的位置。通过将上述结构片段连接整理，即可得到化合物1的平面结构（图1）。该化合物的相对构型通过ROESY试验得到确定。H2’与H3存在noe相关，表明其处于同一平面；H1同时与H2和H5’ 存在noe相关，表明其同处于另一平面，从而确定化合物1的相对构型。该化合物的1H和13CNMR数据归属如下：1HNMR （CD3OD， 500 MHz），δ 0.87 （3H， t， J = 7.5 Hz， H3’）， 1.09 （3H， t， J = 7.5 Hz， H1’）， 139 （3H， s， H5’）， 1.57 （1H， m， H2’b） ， 1.59 （1H， m， H4’b）， 1.66 （1H， m， H4’a）， 1.70 （1H， m， H2’a）， 2.38 （1H， m， H2）， 2.47 （1H， m， H1）， 2.85 （1H， d， J = 14.0 Hz， H6b）， 3.28 （1H， d， J = 14.0 Hz， H6a）， 4.21 （1H， d， J = 10.5 Hz， H3）， 6.98 （1H， d， J = 12.0 Hz， H9）； 13CNMR （CD3OD， 125 MHz），δ 13.1 （q， C3’）， 15.2 （q， C1’）， 20.4 （q， C5’）， 21.0 （t， C2’）， 27.7 （t， C4’）， 35.9 （t， C6）， 43.8 （d， C1）， 50.1 （s， C7）， 52.6 （d， C2）， 74.3 （d， C3）， 131.3 （s， C5）， 133.4 （s， C8）， 150.8 （s， C4）， 151.0 （d， C9）， 165.9 （s， C13）， 166.0 （s， C11）， 169.9 （s， C10）， 177.3 （s， C12）。上述數据与文献值[10]基本一致，确定化合物1为glauconic acid。该化合物属于nonadride类化合物，在天然界很少发现。它结构新颖，多具有独特的药理活性[11-13]。 參考文献
[1]
KIURU P，D′AURIA M V，MULLER C D，et al.Exploring marine resources for bioactive compounds[J].Planta Med，2014，80（14）：1234-1246.
[2] HAGA A，TAMOTO H，ISHINO M，et al.Pyridone alkaloids from a marinederived fungus，Stagonosporopsis cucurbitacearum，and their activities against azoleresistant Candida albicans[J].J Nat Prod，2013，76（4）：750-754.
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[4] LIAO L J，LEE J H，YOU M J，et al.Penicillipyrones A and B，meroterpenoids from a marinederived Penicillium sp. fungus[J].J Nat Prod，2014，77（2）：406-410.
[5] WU Z H，LIU D，PROKSCH P，et al.Punctaporonins HM：Caryophyllenetype sesquiterpenoids from the spongeassociated fungus Hansfordia sinuosae[J].Mar Drugs，2014，12（7）：3904-3916.
[6] WANG R，FU Z D，HE X N，et al.New secondary metabolites produced by the marinederived fungus Aspergillus sp.HDf2[J].Chin J Tropical Crops，2014，35（8）：1658-1662.
[7] WANG R，HE H，ZHAN X F，et al.Antifouling secondary metabolites from the sea urchinassociated fungus Aspergillus sp.HDf2[J].J Anhui Agric Sci，2014，42（25）：8492-8493.
[8] WANG R，LIU T M，SHEN M H，et al.Spiculisporic acids BD，three new γbutenolide derivatives from a sea urchinderived fungus Aspergillus sp.HDf2[J].Molecules，2012，17：13175-13182.
[9] HEWAGE R T，AREE T，MAHIDOL C，et al.One strainmany compounds （OSMAC） method for production of polyketides，azaphilones，and an isochromanone using the endophytic fungus Dothideomycete sp.[J].Phytochemistry，2014，108：87-94.
[10] NIEMINEN S，TAMM C.1Hund 13CNMR.spektroskopie der nonadride[J].Helv Chim Acta，1981，64（8）：2791-2801.
[11] SPENCER P，AGNELLI F，WILLIAMS H J，et al.Biosynthetic studies on the fungal secondary metabolites CP225 917 and CP263 114[J].J Am Chem Soc，2000，122：420-421.
[12] WHITE J D，KIM J，DRAPELA N E.Enantiospecific synthesis of （+）byssochlamic acid，a nonadride from the ascomycete Byssochlamys fulva[J].J Am Chem Soc，2000，122：8665-8671.
[13] CHEN X L，ZHENG Y G，SHEN Y C.Natural products with maleic anhydride structure：nonadrides，tautomycin，chaetomellic anhydride，and other compounds[J].Chem Rev，2007，107（5）：1777-1830.