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【摘 要】目的：研究RhoA在食管癌组织中的表达水平，以及探讨RhoA与食管癌临床病理的关系。 方法：收集40例食管癌病人手术切除的癌组织、癌旁组织及正常组织，采用实时荧光逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫印迹法（Western-blot）检测RhoA mRNA和蛋白的表达水平。结果：RhoA mRNA及蛋白在食管正常组织、癌旁组织、癌组织中表达逐步增强，差异具有统计学意义（P<0.05）。RhoA mRNA和蛋白与食管癌的TNM分期、浸润程度、淋巴结转移有关（P<0.05），而与性别、年龄、肿瘤类型及分化程度均无显著差异（P>0.05）。結论：RhoA在食管癌中过表达，与食管癌的发生发展密切相关，并可能在食管癌的侵袭及转移过程中起重要作用。
【关键词】 RhoA；食管癌；侵袭；转移
【中图分类号】R735 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0161—02
食管癌（Oesophageal cancer） 是世界一些国家和地区常见的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2%。中国是世界上食管癌的高发国家，死亡率居消化道恶性肿瘤第2位，年平均死亡率为1.3～90.9/10万，而世界人口标化死亡率为2.7～110.6/10万，其原因在于食管癌对放化疗敏感度差，容易发生血道转移和局部浸润。因此，明确食管癌发生发展以及侵袭转移的分子机制至关重要。 RhoA是Rho家族的一员，Rho家族主要包括Rho（RhoA、RhoB和RhoC）、Rac和cdc42三个亚家族。RhoA在细胞分裂、粘附变形和游走迁移过程中起重要的调控作用[1]。大量研究结果表明，RhoA在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌和肝癌等多种肿瘤中异常表达，且在肿瘤的生物学行为特别是肿瘤的侵袭转移中发生重要的作用。国内外有关RhoA在食管癌发生发展及侵袭转移中作用的研究较少。本研究应用Real-Time RT-PCR和免疫印迹法检测RhoA mRNA及蛋白在食管癌中的表达水平，分析其与食管癌临床病理特征之间的关系，从而为RhoA参与食管癌发生发展及侵袭转移提供临床依据。
1材料与方法
1.1一般资料 收集2011年5月至2013年5月入住我院手术切除的食管癌组织标本40例，距癌组织8 cm以内归为癌旁组织，距癌组织8 cm以外视为正常组织。全部标本均经临床和病理组织学切片证实，标本收集均获取患者同意并获得医学伦理委员会批准。食管癌患者40例，其中女性18例，男性22例，年龄28～65岁，平均年龄49.50±7.25。根据食管癌最新国际分期标准进行TNM分期，0期+I期7例，II期11例，III期10例，IV期12例。其中8例术前诊断淋巴结转移，放疗后行手术治疗。
1.2试剂与仪器
鼠抗人RhoA及GAPDH单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，BCA蛋白定量试剂盒购自江苏碧云天公司，Trizol及M-MLV First Strand Kit 购自美国Invitrogen公司，目的基因RhoA和作为内参的b-actin均由广州达安基因股份有限公司完成。 STATFA2100酶标仪为美国Awareness公司产品， Mx3000p型荧光定量PCR仪为Stratagene公司产品，电泳仪及凝胶成像系统仪器均为美国Bio-Rad公司产品。
1.3检测方法 （1）Real-Time RT-PCR测定RhoA mRNA的表达 严格按照说明书操作步骤加入Trizol试剂，提取食管癌组织、癌旁组织及正常组织总RNA后检测RNA浓度。RhoA引物及探针序列：，探针（5’-FAM-CACCACGGCCGAGCGGGA-TAMRA-3’）。 取总RNA反转录为cDNA，反应条件：37℃ 1小时，然后95℃3分钟。然后用cDNA模板做实时荧光定量PCR反应，反应条件：93℃ 2分钟；然后94℃ 30秒，55℃ 1分钟，共40个循环。PCR完成后可得出各检测样本的阈值循环数（Cycle threshold， Ct值），从而可以计算RhoA mRNA的相对表达量；（2）Western-blot检测食管组织中RhoA的表达 将冻存在液氮中的食管癌组织、癌旁组织和正常组织标本各40例用 PBS充分清洗后置入碾钵中，按操作说明加入组织裂解液，碾磨后转移到离心管中。以12000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液保存于EP管中备用。用BCA法测定蛋白含量。将各组组织的总蛋白提取液与5×SDS-PAGE上样缓冲液混合（4：1），100℃变性5分钟，冰上骤冷后上样。先将电压调至80伏，待样品泳动至分离胶时，调电压至110伏，待溴酚蓝至胶底时终止电泳并将凝胶中的蛋白质电转至硝酸纤维素膜上。转膜条件为：100V恒压转移50分钟。加入封闭液在室温下孵育2小时，然后用封闭液稀释的一抗（RhoA单克隆抗体稀释比为1：200；GAPDH单克隆抗体稀释比为1：500）4℃孵育过夜。漂洗后置于用封闭液稀释的二抗（抗小鼠IgG-HRP抗体稀释比为1：1000）中室温孵育1 小时。漂洗后用ECL检测液显色， 全自动电泳凝胶成像系统分析仪成像并对免疫印迹条带进行半定量分析。用GAPDH蛋白为内参照，以RhoA蛋白的光密度值与GAPDH光密度值之比作为各组织中蛋白的相对表达量。
1.4统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组间用单因素方差分析（one way ANOVA），组内比较采用重复测量数据的方差分析（repeated measures）或配对t检验。以=0.05作为检验水准，P<0.05时认为差异有统计学意义。
2结果
2.1不同组织中RhoA mRNA和RhoA蛋白表达的比较 见表1。
2.2 RhoA表达与食管癌临床病理特征的关系 见表2。 3 讨论
Rho蛋白为GTP酶， 分子量大小约20～25kD， 可结合并水解鸟苷酸。Rho家族成员在肿瘤的生物学行为特别是肿瘤的侵袭转移及其它人类疾病中发挥着重要的作用。RhoA是Rho家族中研究较多的成员之一，其在人类多种恶性肿瘤中异常表达，可调节多种转录因子的活性，参与肿瘤的发生和发展。我们采用RT-PCR和Western-blot证实了RhoA在食管正常组织、癌旁组织以及癌组织中表达水平逐步增强，RhoA表达量在食管癌组织中较癌旁组织及正常组织明显增多，这些结果和RhoA在乳腺癌，前列腺癌，结直肠癌，非小细胞肺癌及肝癌等组织中均较正常组织高表達相一致。有学者进一步研究发现，RhoA能促进肺腺癌细胞株A549出现恶性表征[2]。综上，我们不难看出RhoA与食管癌的发生发展密切相关，但其具体作用机制仍不明确。许多学者证实RhoA 基因自身具有转化作用[3]， 且Rho家族可参与多种癌基因所致的细胞恶性转化过程。有研究发现，RhoA可参与ras基因的致转化作用[4] ， 其分子机制为RhoA可调控细胞增殖， 细胞增殖进入S期需要RhoA参与[5] 。另有学者发现，RhoA表达增加可使p21表达减少， 从而促进细胞增殖[6]。RhoA是细胞内重要的信号转导蛋白， 有可能通过激活下游的信号传导通路调节细胞的增殖、基因表达从而参与肿瘤发生发展的过程。我们研究发现，RhoA表达水平与肿瘤TNM分期、浸润程度以及有无淋巴结转移密切相关。RhoA在III期和IV期食管癌中的表达较I期和II期明显增高，同时其在发生淋巴结转移的食管癌中也较无转移的增高，说明RhoA高表达可能在食管癌的侵袭转移过程中发挥了重要的作用，提示RhoA及其靶蛋白ROCK/ Rho激酶可参与细胞运动和转移过程。在人肾小管上皮细胞HK2的研究中发现， 活化的RhoA可以增加上皮间质转化， 并且下调E-cadherin的表达从而增强细胞的运动和迁移能力[7]。由于细胞运动和迁移与肿瘤侵袭转移密切相关，所以我们推测高表达的RhoA可通过增强细胞运动和迁移能力促进食管癌的侵袭转移，但RhoA究竟是通过何种分子机制促进食管癌侵袭转移有待进一步研究。
总之，RhoA在食管癌中存在高表达，且与食管癌TNM分期、浸润程度及有无淋巴结转移密切相关，RhoA在很大程度上参与了食管癌侵袭转移的过程。 RhoA的过度表达可能提示食管癌的不良预后，检测RhoA的表达水平可能为食管癌预后判断提供依据。RhoA在食管癌的侵袭和转移过程中发挥怎样的作用还有待更多的实验加以探讨。对RhoA与肿瘤相关性的深入研究，将有助于进一步揭示肿瘤侵袭转移的分子机制，为肿瘤的临床治疗和预防提供帮助。
参考文献：
[1] Boettner B， Van Aelst L. The role of Rho GTPases in disease development [J]. Gene， 2002， 286（2）：155-74.
[2] Delarue FL， Taylor BS， Sebti SM. Ras and RhoA suppress whereas RhoB enhances cytokine-induced transcription of nitric oxide synthase-2 in human normal liver AKN-1 cells and lung cancer A-549 cells [J]. Oncogene， 2001， 20（45）： 6531-6537.
[3] Khosravi-Far R， Solski PA， Clark GJ， et al. Activation of Rac1， RhoA， and mitogen-activated protein kinases is required for Ras transformation [J]. Mol Cell Biol， 1995， 15（11）： 6443-6453.
[4] Sahai E， Olson MF， Marshall CJ. Cross-talk between Ras and Rho signalling pathways in transformation favours proliferation and increased motility [J]. EMBO J， 2001， 20（4）： 755-766.
[5] Olson MF， Ashworth A， Hall A. An essential role for Rho， Rac and Cdc42 GTPases in cell cycle progression through G1 [J]. Science， 1995， 269（5228）： 1270-1272.
[6] Bhowmick NA， Ghiassi M， Bakin A， et al. Transforming growth factor-β1 mediates epithelial to mesenchymal transdifferentiation through a RhoA-dependent mechanism [J]. Mol Biol Cell， 2001， 12（1）： 27-36.
[7] Bartolomé RA， Gálvez BG， Longo N， et al. Stromal cell-derived factor-1alpha promotes melanoma cell invasion across basement membranes involving stimulation of membrane-type 1 matrix metalloproteinase and Rho GTPase activities [J]. Cancer Res， 2004， 64（7）： 2534-2543.
【关键词】 RhoA；食管癌；侵袭；转移
【中图分类号】R735 【文献标识码】A 【文章编号】1004—7484（2013）09—0161—02
食管癌（Oesophageal cancer） 是世界一些国家和地区常见的恶性肿瘤，占所有恶性肿瘤的2%。中国是世界上食管癌的高发国家，死亡率居消化道恶性肿瘤第2位，年平均死亡率为1.3～90.9/10万，而世界人口标化死亡率为2.7～110.6/10万，其原因在于食管癌对放化疗敏感度差，容易发生血道转移和局部浸润。因此，明确食管癌发生发展以及侵袭转移的分子机制至关重要。 RhoA是Rho家族的一员，Rho家族主要包括Rho（RhoA、RhoB和RhoC）、Rac和cdc42三个亚家族。RhoA在细胞分裂、粘附变形和游走迁移过程中起重要的调控作用[1]。大量研究结果表明，RhoA在乳腺癌、前列腺癌、结直肠癌、非小细胞肺癌和肝癌等多种肿瘤中异常表达，且在肿瘤的生物学行为特别是肿瘤的侵袭转移中发生重要的作用。国内外有关RhoA在食管癌发生发展及侵袭转移中作用的研究较少。本研究应用Real-Time RT-PCR和免疫印迹法检测RhoA mRNA及蛋白在食管癌中的表达水平，分析其与食管癌临床病理特征之间的关系，从而为RhoA参与食管癌发生发展及侵袭转移提供临床依据。
1材料与方法
1.1一般资料 收集2011年5月至2013年5月入住我院手术切除的食管癌组织标本40例，距癌组织8 cm以内归为癌旁组织，距癌组织8 cm以外视为正常组织。全部标本均经临床和病理组织学切片证实，标本收集均获取患者同意并获得医学伦理委员会批准。食管癌患者40例，其中女性18例，男性22例，年龄28～65岁，平均年龄49.50±7.25。根据食管癌最新国际分期标准进行TNM分期，0期+I期7例，II期11例，III期10例，IV期12例。其中8例术前诊断淋巴结转移，放疗后行手术治疗。
1.2试剂与仪器
鼠抗人RhoA及GAPDH单克隆抗体购自美国Santa Cruz公司，BCA蛋白定量试剂盒购自江苏碧云天公司，Trizol及M-MLV First Strand Kit 购自美国Invitrogen公司，目的基因RhoA和作为内参的b-actin均由广州达安基因股份有限公司完成。 STATFA2100酶标仪为美国Awareness公司产品， Mx3000p型荧光定量PCR仪为Stratagene公司产品，电泳仪及凝胶成像系统仪器均为美国Bio-Rad公司产品。
1.3检测方法 （1）Real-Time RT-PCR测定RhoA mRNA的表达 严格按照说明书操作步骤加入Trizol试剂，提取食管癌组织、癌旁组织及正常组织总RNA后检测RNA浓度。RhoA引物及探针序列：，探针（5’-FAM-CACCACGGCCGAGCGGGA-TAMRA-3’）。 取总RNA反转录为cDNA，反应条件：37℃ 1小时，然后95℃3分钟。然后用cDNA模板做实时荧光定量PCR反应，反应条件：93℃ 2分钟；然后94℃ 30秒，55℃ 1分钟，共40个循环。PCR完成后可得出各检测样本的阈值循环数（Cycle threshold， Ct值），从而可以计算RhoA mRNA的相对表达量；（2）Western-blot检测食管组织中RhoA的表达 将冻存在液氮中的食管癌组织、癌旁组织和正常组织标本各40例用 PBS充分清洗后置入碾钵中，按操作说明加入组织裂解液，碾磨后转移到离心管中。以12000 r/min，4 ℃离心15 min，取上清液保存于EP管中备用。用BCA法测定蛋白含量。将各组组织的总蛋白提取液与5×SDS-PAGE上样缓冲液混合（4：1），100℃变性5分钟，冰上骤冷后上样。先将电压调至80伏，待样品泳动至分离胶时，调电压至110伏，待溴酚蓝至胶底时终止电泳并将凝胶中的蛋白质电转至硝酸纤维素膜上。转膜条件为：100V恒压转移50分钟。加入封闭液在室温下孵育2小时，然后用封闭液稀释的一抗（RhoA单克隆抗体稀释比为1：200；GAPDH单克隆抗体稀释比为1：500）4℃孵育过夜。漂洗后置于用封闭液稀释的二抗（抗小鼠IgG-HRP抗体稀释比为1：1000）中室温孵育1 小时。漂洗后用ECL检测液显色， 全自动电泳凝胶成像系统分析仪成像并对免疫印迹条带进行半定量分析。用GAPDH蛋白为内参照，以RhoA蛋白的光密度值与GAPDH光密度值之比作为各组织中蛋白的相对表达量。
1.4统计学处理 采用SPSS18.0统计软件进行统计学分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，各组间用单因素方差分析（one way ANOVA），组内比较采用重复测量数据的方差分析（repeated measures）或配对t检验。以=0.05作为检验水准，P<0.05时认为差异有统计学意义。
2结果
2.1不同组织中RhoA mRNA和RhoA蛋白表达的比较 见表1。
2.2 RhoA表达与食管癌临床病理特征的关系 见表2。 3 讨论
Rho蛋白为GTP酶， 分子量大小约20～25kD， 可结合并水解鸟苷酸。Rho家族成员在肿瘤的生物学行为特别是肿瘤的侵袭转移及其它人类疾病中发挥着重要的作用。RhoA是Rho家族中研究较多的成员之一，其在人类多种恶性肿瘤中异常表达，可调节多种转录因子的活性，参与肿瘤的发生和发展。我们采用RT-PCR和Western-blot证实了RhoA在食管正常组织、癌旁组织以及癌组织中表达水平逐步增强，RhoA表达量在食管癌组织中较癌旁组织及正常组织明显增多，这些结果和RhoA在乳腺癌，前列腺癌，结直肠癌，非小细胞肺癌及肝癌等组织中均较正常组织高表達相一致。有学者进一步研究发现，RhoA能促进肺腺癌细胞株A549出现恶性表征[2]。综上，我们不难看出RhoA与食管癌的发生发展密切相关，但其具体作用机制仍不明确。许多学者证实RhoA 基因自身具有转化作用[3]， 且Rho家族可参与多种癌基因所致的细胞恶性转化过程。有研究发现，RhoA可参与ras基因的致转化作用[4] ， 其分子机制为RhoA可调控细胞增殖， 细胞增殖进入S期需要RhoA参与[5] 。另有学者发现，RhoA表达增加可使p21表达减少， 从而促进细胞增殖[6]。RhoA是细胞内重要的信号转导蛋白， 有可能通过激活下游的信号传导通路调节细胞的增殖、基因表达从而参与肿瘤发生发展的过程。我们研究发现，RhoA表达水平与肿瘤TNM分期、浸润程度以及有无淋巴结转移密切相关。RhoA在III期和IV期食管癌中的表达较I期和II期明显增高，同时其在发生淋巴结转移的食管癌中也较无转移的增高，说明RhoA高表达可能在食管癌的侵袭转移过程中发挥了重要的作用，提示RhoA及其靶蛋白ROCK/ Rho激酶可参与细胞运动和转移过程。在人肾小管上皮细胞HK2的研究中发现， 活化的RhoA可以增加上皮间质转化， 并且下调E-cadherin的表达从而增强细胞的运动和迁移能力[7]。由于细胞运动和迁移与肿瘤侵袭转移密切相关，所以我们推测高表达的RhoA可通过增强细胞运动和迁移能力促进食管癌的侵袭转移，但RhoA究竟是通过何种分子机制促进食管癌侵袭转移有待进一步研究。
总之，RhoA在食管癌中存在高表达，且与食管癌TNM分期、浸润程度及有无淋巴结转移密切相关，RhoA在很大程度上参与了食管癌侵袭转移的过程。 RhoA的过度表达可能提示食管癌的不良预后，检测RhoA的表达水平可能为食管癌预后判断提供依据。RhoA在食管癌的侵袭和转移过程中发挥怎样的作用还有待更多的实验加以探讨。对RhoA与肿瘤相关性的深入研究，将有助于进一步揭示肿瘤侵袭转移的分子机制，为肿瘤的临床治疗和预防提供帮助。
参考文献：
[1] Boettner B， Van Aelst L. The role of Rho GTPases in disease development [J]. Gene， 2002， 286（2）：155-74.
[2] Delarue FL， Taylor BS， Sebti SM. Ras and RhoA suppress whereas RhoB enhances cytokine-induced transcription of nitric oxide synthase-2 in human normal liver AKN-1 cells and lung cancer A-549 cells [J]. Oncogene， 2001， 20（45）： 6531-6537.
[3] Khosravi-Far R， Solski PA， Clark GJ， et al. Activation of Rac1， RhoA， and mitogen-activated protein kinases is required for Ras transformation [J]. Mol Cell Biol， 1995， 15（11）： 6443-6453.
[4] Sahai E， Olson MF， Marshall CJ. Cross-talk between Ras and Rho signalling pathways in transformation favours proliferation and increased motility [J]. EMBO J， 2001， 20（4）： 755-766.
[5] Olson MF， Ashworth A， Hall A. An essential role for Rho， Rac and Cdc42 GTPases in cell cycle progression through G1 [J]. Science， 1995， 269（5228）： 1270-1272.
[6] Bhowmick NA， Ghiassi M， Bakin A， et al. Transforming growth factor-β1 mediates epithelial to mesenchymal transdifferentiation through a RhoA-dependent mechanism [J]. Mol Biol Cell， 2001， 12（1）： 27-36.
[7] Bartolomé RA， Gálvez BG， Longo N， et al. Stromal cell-derived factor-1alpha promotes melanoma cell invasion across basement membranes involving stimulation of membrane-type 1 matrix metalloproteinase and Rho GTPase activities [J]. Cancer Res， 2004， 64（7）： 2534-2543.