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【摘要】 目的：通过纤支镜取材组织贴块法，气液相界面培养，将人的支气管上皮细胞诱导分化成具有纤毛和粘液分泌功能的上皮细胞，从结构和功能上，使其更贴近体内支气管上皮细胞的自然生长状态。方法：采用无血清支气管上皮培养基，对经纤支镜活检获得的支气管粘膜进行培养获得的细胞进行原代培养和传代，利用气液相界面培养，无血清支气管上皮细胞生长培养基诱导，对支气管上皮细胞进行培养。通过倒置显微镜观察和鉴定细胞。结果：此方法获得的细胞具有纤毛和粘液分泌功能。细胞角蛋白表达阳性。结论：经纤支镜粘膜活检、组织贴块法，气液相界面培养的细胞更贴近生理状态，为进一步研究呼吸系统疾病提供了良好的模型。
【关键词】 纤支镜粘膜活检；支气管上皮细胞；气液相界面；细胞培养
支气管上皮是气道与外界环境接触的第一道防线，不仅是炎症介质作用的靶细胞，还作为效应细胞合成、释放细胞因子、炎性介质从而参与气道炎症及免疫反应。黏液纤毛传输系统是由纤毛与纤毛表面的黏液层构成，通过纤毛的节律性摆动，推动黏液层运动，把附着于黏液的异物颗粒、细菌和坏死细胞碎屑排出呼吸道，发挥重要的机械防御作用，对于维持正常的气道生理功能具有重要作用[1]。在气道疾病的基础及临床研究中，体外培养的原代支气管上皮细胞极为重要。目前国内外对支气管上皮细胞的基础研究多数以永生化的细胞株为研究对象，且多为单层扁平上皮细胞，不能很好执行原有在体的支气管上皮细胞功能。本实验通过纤支镜取材组织贴块法建立原代支气管上皮细胞培养的基础上，利用气液相界面培养,将气道上皮细胞诱导分化成带有纤毛和粘液分泌功能的上皮细胞，以便使支气管上皮细胞从功能和结构上更贴近体内自然生长状态，为研究呼吸系统疾病提供更好的研究工具。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1标本来源 经患者同意，取东莞市人民医院纤支镜活检的正常的支气管粘膜组织，无菌条件下放入含青、链霉素双抗的冷PBS中备用。
1.1.2试剂 MEM培养基、0.25%胰酶/EDTA为美国Gibco公司产品。支气管上皮细胞生长培养基为德国Promocell公司产品。人的胎盘胶原Ⅵ为美国Sigma公司产品。鼠抗人的角蛋白8单克隆抗体和超敏即用型免疫组化试剂盒均购自福州迈新公司。胎牛血清为杭州四季青产品。
1.1.3耗材 细胞培养板、细胞冻存管均购自美国Corning公司。Millicell培养小室购自美国Millipore公司。
1.1.4培养液配制 将支气管上皮细胞生长培养基配置成含有0.4%(V/V)牛垂体提取物、0.5ug/ml人表皮生长因子、5mg/ml人胰岛素、0.5mg/ml氢化可的松、0.5mg/ml肾上腺素、6.7ug/ml三碘-L-甲腺原氨酸、10mg/ml人转铁蛋白、0.1ug/ml视黄酸的无血清培养液于4℃避光保存。
1.2实验方法
1.2.1人的支气管上皮细胞的原代培养
经纤支镜用一次性无菌活检钳分别在镜下所见粘膜正常的支气管分瘠处钳取支气管粘膜数块，放入含100u/ml青霉素和100ug/ml的链霉素的PBS清洗数次，用移液枪将其移至预先铺有胎盘胶原Ⅵ的24孔培养板中，加无血清的支气管上皮细胞生长培养基（200ul/孔）入370C、 5% CO2培养箱中培养。以后隔2天换液一次[2]。
1.2.2支气管上皮细胞气液相界面的培养和诱导
当上皮细胞生长铺满培养板底、生长成片时, 用移液枪将组织块移到预先铺有胶原的新的细胞培养板中，加支气管上皮细胞生长培养基继续培养（每块组织块可反复重贴生长7~8次）。然后将原代已生长成片的上皮细胞用胰蛋白酶(0.25 %) / EDTA(0.02 %)混合液消化传代, 以无血清支气管上皮细胞生长培养基调整细胞密度，以7.5×104/cm2细胞密度接种至预先铺有胎盘胶原的millicell小室中，同时下室也加入无血清支气管上皮细胞生长培养基入37℃、 5% CO2培养箱中培养，每隔2天换液一次，直到用Millicell-ERS 阻力系统测细胞跨膜压差＞1000Ω.cm2。去掉上室的培养基，建立气液相界面培养[3、4]，下室继续加无血清支气管上皮细胞生长培养基培养，每隔2天换液一次。气液相界面培养d5~10天用于实验。
1.2.3支气管上皮细胞的鉴定
用倒置显微镜和扫描电镜观察支气管上皮细胞的生长状态、形态学变化，拍照记录。用鼠抗人细胞角蛋白8单克隆抗体行免疫组化鉴定,具体方法参照试剂盒说明书进行。
2结果
镜下观察原代支气管上皮细胞的生长情况，培养初期可见组织块边缘纤毛上皮细胞的纤毛摆动活跃，培养2~3天可见组织块周边有少许上皮细胞爬出，此后组织块周围的上皮样细胞逐渐增多，数天后上皮样细胞覆盖面积逐渐增大，近组织块区域的上皮细胞生长密集，远离组织块区域上皮细胞生长相对稀疏。待细胞生长成片，可见明显的“铺路石”征。镜下观察上皮细胞呈扁平状，多边形，呈铺路鹅卵石样分布生长，符合上皮细胞生长特征（图a）。气液相界面培养d0天扫描电镜下未见细胞有纤毛长出（图c），d3天可见部分细胞细胞一侧上有纤毛长出，多呈分散或成簇状分布，d10天这种表现最明显，具有气管上皮细胞的特征（图d）。用鼠抗人细胞角蛋白抗体进行细胞免疫组化鉴定,可见大部分细胞呈棕色阳性染色（图b）。
3讨论
人的支气管上皮细胞的分离和培养是进行呼吸系统疾病临床和基础研究的关键。原代培养的细胞在生理上接近体内的状态,在细胞生物学研究中具有重要价值。随着纤支镜的广泛应用, 在纤支镜直视下活检取材，大大方便了正常及病理状态下人体原代支气管上皮细胞的获得。本实验通过纤支镜活检取材，组织贴块法培养原代上皮细胞，对细胞损伤小，且操作简单、快捷；每块组织块可重贴7~8次，重贴后的组织块上皮细胞爬出更快；纤毛上皮细胞自组织块周围直接爬出，更好地保留了原有的生物学特性。支气管上皮细胞较难培养，对生长条件要求较高，本实验通过纤支镜取材获得人的支气管上皮细胞，最大限度地保留了在体支气管上皮细胞的生长状态，在此基础上进行原代培养，消化传代，种植于用胶原改良的半透明支持膜上，通过气液相界面方式进行培养，用无血清支气管上皮生长培养基进行诱导，支气管上皮细胞可分化成异基因的、多种细胞混杂生长（纤毛细胞、分泌细胞以及基底细胞）的体系，与原有的单一永生化的单层扁平的支气管上皮细胞株相比，本实验方法体外培养的支气管上皮细胞从功能和结构上，更贴近体内自然生长状态，为进一步研究支气管上皮的功能奠定了良好的基础。
气管－支气管上皮为假复层纤毛柱状上皮,由纤毛细胞、杯状细胞、刷细胞、基细胞和小颗粒细胞等组成。这些上皮细胞特征性地表达角蛋白,可用抗角蛋白抗体进行免疫细胞化学染色鉴定。通常情况下，支气管上皮细胞离体培养一定时间后,细胞形状发生变化,呈梭形或球形,纤毛结构退化或消失[3]。气液相界面培养是将气管上皮细胞种植在胶原凝胶膜上培养一段时间，待细胞完全融合后，再将胶原凝胶膜上的培养基去掉，使其悬浮在培养液中生长。气液相界面培养的意义在于不仅使上皮细胞向极性分化，而且使极性分化的分泌细胞开始分泌糖蛋白[4]。有关气液相界面培养促使细胞分化的机制有两点：其一是悬浮的胶原凝胶收缩，使原来扁平伸展的上皮细胞随着胶原凝胶收缩而变为柱状上皮细胞，使细胞形态发生变化从而诱导分化；其二是气液相界面培养使细胞营养供给的方式发生变化引起细胞分化，即细胞原来从上方吸收营养物质，改为细胞从底部吸收，形成与体内相似的生长方式。支气管上皮细胞在体外培养难以长期生存,对生长条件有极高的要求。
实验过程中有以下体会:1）由于气道为开放性组织, 与外界大气相通, 黏膜表面有细菌定植, 容易污染, 因此尽可能做到无菌操作，培养前用含双抗的PBS预先处理十分关键。2)分离得到支气管上皮细胞后,尽量缩短细胞离体到体外培养的时间，时间越短，成活率越高，细胞爬出的速度越快，生长状态越好。3）上皮细胞贴壁生长是培养存活的关键,经胶原涂布的Millicell,膜表面性状得以改善,为细胞生长提供了很好地生长基质，有利于细胞生长。4）在细胞液面下培养的过程中，培养基的液面高度对气管上皮细胞的生长及分化有明显影响。细胞在1.4mm液面高度条件下培养对细胞的增殖较为有利。待细胞融合后，以0mm条件培养，对细胞的分化成熟以及复层形成较佳。这可能与低液面高度改善了细胞O2的摄入和CO2的排除有关[5]。
参考文献
[1]Senior BA，Kennedy DW． Management Of sinusitis asthmatic patient．Ann Allergy Asthma lmmunoI，1996，77：6-19．
[2]高元妹,张平.经纤维支气管镜取材人的支气管上皮细胞的原代培养.广东医学.2011;32(5)18-19.
[3]高元妹,徐军.小鼠气管上皮细胞气液相界面培养.广东医学.2008,29（2）217-219.
[4]Yingjian You,Edward J. Richer, Tao Huang, et al.Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells:selection of a proliferative population. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol283:L1315-L1321,2002.
[5]黄宁,唐彬,潘小玲,等.人气管上皮气液界面无血清培养. 基础医学与临床.,2000;20(2)89-92.
附图：
图a，融合的支气管上皮细胞呈扁平状、多边形，铺路石样分布生长。(倒置显微镜X10)
图b，用鼠抗人的角蛋白8抗体鉴定人的支气管上皮细胞见细胞胞浆呈棕黄色着色。(倒置显微镜X20)
图c,扫描电镜观察支气管上皮细胞气液相界面培养d0天 的形态学变化。
图d,扫描电镜观察支气管上皮细胞气液相界面培养d10天 的形态学变化。
【关键词】 纤支镜粘膜活检；支气管上皮细胞；气液相界面；细胞培养
支气管上皮是气道与外界环境接触的第一道防线，不仅是炎症介质作用的靶细胞，还作为效应细胞合成、释放细胞因子、炎性介质从而参与气道炎症及免疫反应。黏液纤毛传输系统是由纤毛与纤毛表面的黏液层构成，通过纤毛的节律性摆动，推动黏液层运动，把附着于黏液的异物颗粒、细菌和坏死细胞碎屑排出呼吸道，发挥重要的机械防御作用，对于维持正常的气道生理功能具有重要作用[1]。在气道疾病的基础及临床研究中，体外培养的原代支气管上皮细胞极为重要。目前国内外对支气管上皮细胞的基础研究多数以永生化的细胞株为研究对象，且多为单层扁平上皮细胞，不能很好执行原有在体的支气管上皮细胞功能。本实验通过纤支镜取材组织贴块法建立原代支气管上皮细胞培养的基础上，利用气液相界面培养,将气道上皮细胞诱导分化成带有纤毛和粘液分泌功能的上皮细胞，以便使支气管上皮细胞从功能和结构上更贴近体内自然生长状态，为研究呼吸系统疾病提供更好的研究工具。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1标本来源 经患者同意，取东莞市人民医院纤支镜活检的正常的支气管粘膜组织，无菌条件下放入含青、链霉素双抗的冷PBS中备用。
1.1.2试剂 MEM培养基、0.25%胰酶/EDTA为美国Gibco公司产品。支气管上皮细胞生长培养基为德国Promocell公司产品。人的胎盘胶原Ⅵ为美国Sigma公司产品。鼠抗人的角蛋白8单克隆抗体和超敏即用型免疫组化试剂盒均购自福州迈新公司。胎牛血清为杭州四季青产品。
1.1.3耗材 细胞培养板、细胞冻存管均购自美国Corning公司。Millicell培养小室购自美国Millipore公司。
1.1.4培养液配制 将支气管上皮细胞生长培养基配置成含有0.4%(V/V)牛垂体提取物、0.5ug/ml人表皮生长因子、5mg/ml人胰岛素、0.5mg/ml氢化可的松、0.5mg/ml肾上腺素、6.7ug/ml三碘-L-甲腺原氨酸、10mg/ml人转铁蛋白、0.1ug/ml视黄酸的无血清培养液于4℃避光保存。
1.2实验方法
1.2.1人的支气管上皮细胞的原代培养
经纤支镜用一次性无菌活检钳分别在镜下所见粘膜正常的支气管分瘠处钳取支气管粘膜数块，放入含100u/ml青霉素和100ug/ml的链霉素的PBS清洗数次，用移液枪将其移至预先铺有胎盘胶原Ⅵ的24孔培养板中，加无血清的支气管上皮细胞生长培养基（200ul/孔）入370C、 5% CO2培养箱中培养。以后隔2天换液一次[2]。
1.2.2支气管上皮细胞气液相界面的培养和诱导
当上皮细胞生长铺满培养板底、生长成片时, 用移液枪将组织块移到预先铺有胶原的新的细胞培养板中，加支气管上皮细胞生长培养基继续培养（每块组织块可反复重贴生长7~8次）。然后将原代已生长成片的上皮细胞用胰蛋白酶(0.25 %) / EDTA(0.02 %)混合液消化传代, 以无血清支气管上皮细胞生长培养基调整细胞密度，以7.5×104/cm2细胞密度接种至预先铺有胎盘胶原的millicell小室中，同时下室也加入无血清支气管上皮细胞生长培养基入37℃、 5% CO2培养箱中培养，每隔2天换液一次，直到用Millicell-ERS 阻力系统测细胞跨膜压差＞1000Ω.cm2。去掉上室的培养基，建立气液相界面培养[3、4]，下室继续加无血清支气管上皮细胞生长培养基培养，每隔2天换液一次。气液相界面培养d5~10天用于实验。
1.2.3支气管上皮细胞的鉴定
用倒置显微镜和扫描电镜观察支气管上皮细胞的生长状态、形态学变化，拍照记录。用鼠抗人细胞角蛋白8单克隆抗体行免疫组化鉴定,具体方法参照试剂盒说明书进行。
2结果
镜下观察原代支气管上皮细胞的生长情况，培养初期可见组织块边缘纤毛上皮细胞的纤毛摆动活跃，培养2~3天可见组织块周边有少许上皮细胞爬出，此后组织块周围的上皮样细胞逐渐增多，数天后上皮样细胞覆盖面积逐渐增大，近组织块区域的上皮细胞生长密集，远离组织块区域上皮细胞生长相对稀疏。待细胞生长成片，可见明显的“铺路石”征。镜下观察上皮细胞呈扁平状，多边形，呈铺路鹅卵石样分布生长，符合上皮细胞生长特征（图a）。气液相界面培养d0天扫描电镜下未见细胞有纤毛长出（图c），d3天可见部分细胞细胞一侧上有纤毛长出，多呈分散或成簇状分布，d10天这种表现最明显，具有气管上皮细胞的特征（图d）。用鼠抗人细胞角蛋白抗体进行细胞免疫组化鉴定,可见大部分细胞呈棕色阳性染色（图b）。
3讨论
人的支气管上皮细胞的分离和培养是进行呼吸系统疾病临床和基础研究的关键。原代培养的细胞在生理上接近体内的状态,在细胞生物学研究中具有重要价值。随着纤支镜的广泛应用, 在纤支镜直视下活检取材，大大方便了正常及病理状态下人体原代支气管上皮细胞的获得。本实验通过纤支镜活检取材，组织贴块法培养原代上皮细胞，对细胞损伤小，且操作简单、快捷；每块组织块可重贴7~8次，重贴后的组织块上皮细胞爬出更快；纤毛上皮细胞自组织块周围直接爬出，更好地保留了原有的生物学特性。支气管上皮细胞较难培养，对生长条件要求较高，本实验通过纤支镜取材获得人的支气管上皮细胞，最大限度地保留了在体支气管上皮细胞的生长状态，在此基础上进行原代培养，消化传代，种植于用胶原改良的半透明支持膜上，通过气液相界面方式进行培养，用无血清支气管上皮生长培养基进行诱导，支气管上皮细胞可分化成异基因的、多种细胞混杂生长（纤毛细胞、分泌细胞以及基底细胞）的体系，与原有的单一永生化的单层扁平的支气管上皮细胞株相比，本实验方法体外培养的支气管上皮细胞从功能和结构上，更贴近体内自然生长状态，为进一步研究支气管上皮的功能奠定了良好的基础。
气管－支气管上皮为假复层纤毛柱状上皮,由纤毛细胞、杯状细胞、刷细胞、基细胞和小颗粒细胞等组成。这些上皮细胞特征性地表达角蛋白,可用抗角蛋白抗体进行免疫细胞化学染色鉴定。通常情况下，支气管上皮细胞离体培养一定时间后,细胞形状发生变化,呈梭形或球形,纤毛结构退化或消失[3]。气液相界面培养是将气管上皮细胞种植在胶原凝胶膜上培养一段时间，待细胞完全融合后，再将胶原凝胶膜上的培养基去掉，使其悬浮在培养液中生长。气液相界面培养的意义在于不仅使上皮细胞向极性分化，而且使极性分化的分泌细胞开始分泌糖蛋白[4]。有关气液相界面培养促使细胞分化的机制有两点：其一是悬浮的胶原凝胶收缩，使原来扁平伸展的上皮细胞随着胶原凝胶收缩而变为柱状上皮细胞，使细胞形态发生变化从而诱导分化；其二是气液相界面培养使细胞营养供给的方式发生变化引起细胞分化，即细胞原来从上方吸收营养物质，改为细胞从底部吸收，形成与体内相似的生长方式。支气管上皮细胞在体外培养难以长期生存,对生长条件有极高的要求。
实验过程中有以下体会:1）由于气道为开放性组织, 与外界大气相通, 黏膜表面有细菌定植, 容易污染, 因此尽可能做到无菌操作，培养前用含双抗的PBS预先处理十分关键。2)分离得到支气管上皮细胞后,尽量缩短细胞离体到体外培养的时间，时间越短，成活率越高，细胞爬出的速度越快，生长状态越好。3）上皮细胞贴壁生长是培养存活的关键,经胶原涂布的Millicell,膜表面性状得以改善,为细胞生长提供了很好地生长基质，有利于细胞生长。4）在细胞液面下培养的过程中，培养基的液面高度对气管上皮细胞的生长及分化有明显影响。细胞在1.4mm液面高度条件下培养对细胞的增殖较为有利。待细胞融合后，以0mm条件培养，对细胞的分化成熟以及复层形成较佳。这可能与低液面高度改善了细胞O2的摄入和CO2的排除有关[5]。
参考文献
[1]Senior BA，Kennedy DW． Management Of sinusitis asthmatic patient．Ann Allergy Asthma lmmunoI，1996，77：6-19．
[2]高元妹,张平.经纤维支气管镜取材人的支气管上皮细胞的原代培养.广东医学.2011;32(5)18-19.
[3]高元妹,徐军.小鼠气管上皮细胞气液相界面培养.广东医学.2008,29（2）217-219.
[4]Yingjian You,Edward J. Richer, Tao Huang, et al.Growth and differentiation of mouse tracheal epithelial cells:selection of a proliferative population. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol283:L1315-L1321,2002.
[5]黄宁,唐彬,潘小玲,等.人气管上皮气液界面无血清培养. 基础医学与临床.,2000;20(2)89-92.
附图：
图a，融合的支气管上皮细胞呈扁平状、多边形，铺路石样分布生长。(倒置显微镜X10)
图b，用鼠抗人的角蛋白8抗体鉴定人的支气管上皮细胞见细胞胞浆呈棕黄色着色。(倒置显微镜X20)
图c,扫描电镜观察支气管上皮细胞气液相界面培养d0天 的形态学变化。
图d,扫描电镜观察支气管上皮细胞气液相界面培养d10天 的形态学变化。